Краткий курс биотехнологии Смотрите также: Учебный сайт
Учебные материалы


Краткий курс биотехнологии



3.2 Мутагенез и методы выделения мутантов

В живой клетке одновременно синтезируется множество соединений. В норме обмен веществ в клетке осуществляется в экономичном режиме. Задача биотехнолога состоит в обеспечении сверхсинтеза одного из продуктов метаболизма.

Сверхсинтез может быть осуществлен двумя путями:

1) путем спонтанного изменения генетической природы организма in vivo. Селекция (то есть направленный отбор) из природных высокопродуктивных штаммов может занимать годы;

2) путем индуцированного мутагенеза. Метод основан на использовании мутагенного действия ряда химических соединений (таких как гидроксиламин, нитрозамины, азотистая кислота, бромурацил, алкилирующие агенты и др), ультрафиолетовых и рентгеновских лучей. Мутагены вызывают замены оснований в составе ДНК, а также индуцируют мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания информации. Проводят тотальную проверку (скрининг) полученных клонов (клон – генетически однородное потомство одной клетки). Отбирают наиболее продуктивные.

В результате мутаций микроорганизма исчезает эффект катаболитной репрессии, а индуцибельные ферменты становятся конститутивными, то есть их экспрессия не зависит от присутствия в среде субстрата.

Е
сли необходимо добиться накопления не конечного, а промежуточного продукта биосинтетического пути, то это может быть достигнуто с помощью мутанта, у которого блокирован этап синтеза:

Т
акой мутант ауксотрофен, то есть растёт только при добавлении в среду вещества, служащего продуктом блокированной реакции:

О
днако, возможны компенсирующие мутации, ведущие к активизации альтернативных путей синтеза недостающих соединений:

Тогда микроорганизмы не нуждаются в добавлении вещества Г и накапливают вещество Д в сверхколичествах.

На практике высокопродуктивные штаммы часто обладают двумя видами мутаций: в них ферменты становятся конститутивными, а они сами – ауксотрофными.

3.3 Плазмиды и конъюгация у бактерий

Плазмидами называют бактериальные репликоны (внехромосомные элементы наследственности), стабильно наследуемые. Они представляют собой двуцепочные кольцевые молекулы ДНК с вариабельными молекулярными массами. Их размеры составляют от 1 до 3 % генома бактериальной клетки.

Плазмиды разделяют на конъюгативные, способные самостоятельно перенестись в реципиентные клетки с помощью конъюгации, и неконъюгативные, не обладающие этим свойством. Они детерминируют разные свойства: резистентность к антибиотикам (R-плазмиды), биодеградацию (D-плазмиды) и др.

Например, плазмиды стафилококков несут гены устойчивости к пенициллину, соединениям ртути. Гены устойчивости к тяжелым металлам обнаружены также в составе R-плазмид E. coli. У кишечной палочки, сальмонелл и ряда других бактерий обнаружены Col-плазмиды, обеспечивающие синтез разных колицинов – высокоспецифичных антибиотиков, подавляющих жизнедеятельность других штаммов микроорганизмов того же вида или родственных видов. Количество плазмид в клетке может колебаться от 1 до 100. В целом, чем крупнее плазмида, тем меньше количество ее копий в клетке.



3.4 Фаги и трансдукция

Трансдукция – перенос генетической информации от клетки донора к клетке реципиента, который осуществляется фагом.

Почти каждый известный в настоящее время вид бактерий является хозяином одного или нескольких фагов.

Фаги могут быть вирулентными – лизирующими зараженные ими бактерии – или умеренными – образующими с клеткой-хозяином своеобразный симбиоз. Такие фаги передаются по наследству, могут находиться в клетке в виде автономной плазмиды или интегрироваться в бактериальную хромосому.

Фаги могут нарушать процессы ферментации в результате фаголиза производственных культур бактерий. Также фаги являются важным инструментом генетического анализа и конструирования штаммов бактерий.

Явление трансдукции описали в 1952 г. Н. Циндер и Дж. Ледерберг. Оно основано на том, что в процессе размножения фагов в бактериях иногда образуются частицы, которые наряду с фаговой ДНК или вместо нее содержат фрагменты бактериальной ДНК.

При заражении новых бактериальных клеток они передают им генетические детерминанты предыдущего хозяина.

3.5 Гибридизация эукариотических организмов

Образование гибридов у дрожжей, грибов и водорослей происходит в результате слияния клеток. Если исходные клетки были гаплоидными, то есть содержали только один набор хромосом, то в результате слияния ядер появится диплоидная клетка (зигота), несущая два набора хромосом в одном ядре.

У некоторых микроорганизмов диплоидное ядро сразу подвергается мейозу. У аспергилл, дрожжей, водорослей диплоидное ядро начинает делиться с образованием диплоидных вегетативных клеток. Промышленные штаммы дрожжей часто полиплоидны.

Совмещение ценных качеств родителей при гибридизации эукариотических организмов может происходить также вследствие рекомбинации, к которой приводит мейоз и митотическое расщепление.



3.6 Слияние протопластов или фузия клеток

Термин «протопласты» применяют для обозначения структур, которые образуются после полного удаления клеточной стенки у клеток растений, микроорганизмов, животных. Когда нет уверенности в том, что клеточная стенка целиком отсутствует, то говорят о «сферопластах» и о слиянии и трасформации сферопластов. Таким образом, сферопласты – это частичные протопласты.

Протопласты позволяют исследовать различные свойства мембран, транспорт веществ через плазмоллему.

Для получения протопластов используют несколько методов:

1) выращивание клеток на средах с антибиотиками, высокими концентрациями аминокислот. В результате нарушаются процессы биосинтеза клеточной стенки;

2) основной метод – ферментный лизис клеточной стенки, например, лизоцимом.

С помощью слияния протопластов можно получать генетические рекомбинанты у тех видов и штаммов микроорганизмов, у которых не обнаружены собственные системы обмена наследственной информацией и которые в естественных условиях никогда не скрещиваются между собой.

Следует подчеркнуть, что речь идет об объединении соматических (неполовых) клеток. В настоящее время методом фузии получают гибриды клеток человека и животных, млекопитающих и растений или дрожжей, хотя долгоживущих гибридов не получено. Фузия – универсальный метод для клеток любых микроорганизмов.

После разрушения клеточной стенки протопласты сшивают. Ранее для этого использовался вирус Сендай, в настоящее время используется водорастворимый полимер – полиэтиленгликоль. Протопласты сшиваются, в местах слипания мембран происходит разрыв, и содержимое двух соседних протопластов объединяется. Образующиеся структуры сохраняют способность к восстановлению клеточной стенки. В результате появляются гибридные клетки.

Однако слияния недостаточно для получения гибридных клеток, так как гибриды обладают меньшей способностью к росту и размножению, чем оставшиеся в культуре родительские клетки. Поэтому для получения культуры гибридных клеток используют специальные приемы. Чаще всего применяют селективные среды. Подбираются клетки, обладающие различными генетическими дефектами, и создаётся специальная среда для культивирования. На этой среде смогут расти только гибридные клетки, обладающие восполненными свойствами за счет обеих родительских клеток. Таким образом производят отбор гибридных клеток, то есть гибридная клетка содержит оба родительских хромосомных набора. Хромосомы обеих родительских клеток могут функционировать одновременно, при этом происходит дополнение (на языке генетики – комплементация) признаков.

Исследование гибридов позволяет установить, какая из хромосом ответственна за синтез того или иного белка. С помощью гибридных клеток, полученных слиянием клетки опухоли костного мозга мыши или крысы (так называемой миеломы) с иммунным лимфоцитом, синтезирующим определенные антитела, получают гибридомы. На гибридомах изучают механизмы клеточного размножения, с их помощью получают моноклональные антитела, используют в медицинской диагностике.


Карта сайта

Последнее изменение этой страницы: 2018-09-09;



2010-05-02 19:40
referat 2018 год. Все права принадлежат их авторам! Главная