Сборник лабораторных работ Для студентов вузов Кемерово 2005 Специфичность действия ферментов Учебный сайт
Учебные материалы


Сборник лабораторных работ Для студентов вузов Кемерово 2005



ВЫДЕЛЕНИЕ АМИЛАЗ ИЗ СОЛОДА

Пророщенные зерна ячменя пшеницы и других злаковых растений обладают высокой амилазной активностью. Амилазы (3.3.1.-) – ферменты, катализирующие гидролиз крахмала и родственных полисахаридов, относятся к классу гидролаз (3), подклассу гликозидаз (3.2.), подподклассу D-гликозидаз (3.2.1.). Амилазы гидролизуют как, неизмененные крахмальные зерна, так и оклейстеризованный крахмал. Причем, действие амилаз на оклейстеризованный крахмал значительно эффективнее, чем на неизмененные зерна, поэтому в спиртовой промышленности, перед осахариванием крахмала солодом производят заваривание муки или картофеля.

По свойствам, распространению в природе и способу действия на крахмал различают: α-амилазу, β-амилазу, глюкоамилазу и амилопектин-1,6-глюканогидролазу.

α-Амилаза (К.Ф. 3.2.1.1.) – систематическое название 1,4-α-D-глюкан-глюканогидролаза, старые названия – диастаза, птиалин, гликогеназа, декстриногенамилаза. Этот фермент содержится в слюне, соке поджелудочной железы, плесневых грибах, проросшем зерне пшеницы, ржи, ячменя. Обнаружена активность α-амилазы в непроросших семенах ржи и сорго.

α-Амилаза катализирует без определенного порядка гидролиз внутренних 1,4-α-гликозидных связей в полисахаридах, содержащих три и более остатков α-D-глюкозы. При действии α-амилазы на крахмал образуются главным образом декстрины небольшой молекулярной массы и незначительное количество мальтозы.

α-Амилаза чувствительна к подкислению (оптимум рН 5,6-6,3), но термостабильна (температурный оптимум 65 ºС).

При высокой α-амилазной активности пшеничной муки (обычно полученной из проросшего зерна пшеницы и ржи в тесте происходит накопление декстринов, (декстрины не сбраживаются дрожжами), что приводит к ухудшению качества хлеба – его пористости, физических свойств мякиша, вкуса.

β-Амилаза (КФ 3.2.1.2.), систематическое название 1,4- α-D-глюкан-мальтогидролаза, старые названия – диастаза, сахарогенамилаза, гликогеназа. Этот фермент содержится в непроросшем зерне пшеницы, ржи, ячменя, соевых бобах. Он катализирует гидролиз 1,4-α-гликозидных связей в полисахаридах, последовательно отщепляя остатки мальтозы от нередуцирующих концов цепей. β-Амилаза расщепляет амилозу полностью до мальтозы. Амилопектин она гидролизует с образованием мальтозы и декстринов, дающих коричнево-красное окрашивание с йодом (декстрины более высокой молекулярной массы по сравнению с декстринами, образующимися при действии α-амилазы). Действие β-амилазы прекращается в точках ветвления молекулы амилопектина.

β-Амилаза более активна в кислой среде (оптимум рН 4,8), но термолабильна (температурный оптимум 51˚С). Этот фермент способствует накоплению мальтозы в тесте, что приводит к более интенсивному брожению.

Глюкоамилаза (КФ 3.2.1.3.) или экзо-1,4-α-D-глюкозидаза имеет систематическое название 1,4-α-D-глюкан-глюкогидролаза. Она гидролизует крахмал с образованием преимущественно глюкозы и небольшого количества декстринов. Препараты глюкоамилазы получают из плесеневых грибов. С помощью этого фермента получают из крахмала глюкозную патоку и кристаллическую глюкозу.

Амилопектин-1,6-глюканогидролаза (КФ 3.2.1.41) подвергает гидролизу 1,6-α-гликозидные связи в амилопектине, гликогене.

ХОД РАБОТЫ. 20 г измельченного солода растирают в ступке с небольшим количеством воды до однородной массы и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл объем доводят водой до метки, содержимое перемешивают и оставляют на льду на 2 часа (можно поставить в холодильник на ночь). По истечении времени экстрагирования содержимое перемешивают и центрифугируют в течении 10 мин со скоростью 3000 об/мин. Центрифугат используют в качестве источника амилазы.



ВЫДЕЛЕНИЕ САХАРАЗЫ ИЗ ДРОЖЖЕЙ

Сахараза из дрожжей имеет более правильное рабочее название β-фруктофуранозидаза (КФ 3.2.1.26), катализирует гидролиз β-гликозидных связей в молекулах как сахарозы, так и раффинозы. При этом сахароза расщепляется на глюкозу и фруктозу, а раффиноза – на фруктозу и мелибиозу.

ХОД РАБОТЫ. В фарфоровую ступку вносят 1 г прессованных пекарских дрожжей и тщательно растирают в 3 мл воды в течение 5 мин . Затем добавляют 17 мл воды, перемешивают и ставят ступку в термостат при 37 ˚С на 20 мин. Через каждые 5 мин содержимое перемешивают. По истечении указанного времени смесь переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 мин со скоростью 3,5 тыс об/мин. Надосадочную жидкость сливают в пробирку и используют как водный экстракт сахаразы.

РЕАКТИВЫ. Растворы с массовыми долями: 1% хлорида натрия и крахмала; размолотый солод; раствор Люголя (0,3 г кристаллического йода и 3 г йодида калия растворяют в 5 мл воды и после полного растворения йода объем доводят до 100 мл водой).


КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.

1. Химическая природа ферментов, их строение и структура.

2. Функция ферментов.

3. Сырье и источники для получения ферментов.

4. Источники и техника получения амилаз.

5. Биологическое сырье и техника выделения β-фруктофуранозидазы.

6. Основные этапы и условия выделения ферментов из биологического материала.

7. Характеристика чистого фермента и ферментного препарата.

8. Что такое субстрат, фермент, инкубация?


  1. Как можно обнаружить фермент в экстракте биологического материала?


3.2.Специфичность действия ферментов


Специфичность действия ферментов – это способность катализировать одну или несколько близких реакций, преобразовывать одно вещество или один вид связей. Специфичность ферментов бывает нескольких видов: абсолютная, относительная (групповая), стереохимическая.

Ферменты отличаются от катализаторов небиологической природы высокой специфичностью, что обусловлено индивидуальными особенностями строения активных центров различных ферментов. Пространственная структура активного центра предопределяет не только комплементарность субстрату, но и природу последующих превращений субстрата в фермент- субстратном комплексе, приводящих к образованию соответствующего продукта. Будучи высокоспецифичной, ферментативная реакция протекает в 105-1012 раз быстрее, чем самопроизвольная (спонтанная) реакция.


СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ АМИЛАЗЫ И САХАРАЗЫ


Для изучения специфичности этих ферментов используем амилазу слюны и сахаразу хлебопекарных дрожжей. Амилаза слюны (3.2.1.1) по механизму действия является -амилазой. Катализирует гидролиз -1,4-гликозидных связей в молекуле крахмала (и гликогена) без определенного порядка. Процесс гидролиза происходит как бы ступенчато и может быть выражен в виде схемы:

Крахмал  Амилодекстрины  Эритродекстрины  Ахродекстрины  Мальтодекстрины  Мальтоза. Глубину гидролиза крахмала можно контролировать по цветной реакции с раствором йода (см. табл. 8).

Сахараза из дрожжей имеет более правильное рабочее название -фруктофуранозидаза (3.2.1.26). Катализирует гидролиз -гликозидных связей в молекулах как сахарозы, так и раффинозы, при этом сахароза расщепляется на глюкозу и фруктозу, которые обнаруживаются реакцией Троммера.

ХОД РАБОТЫ. Берут 6 пробирок и пробы для опыта готовят в соответствии с табл. 9.

Таблица 9

Схема изучения специфичности действия ферментов




№ пробы

Субстрат,

3 мл


Фермент, 1 мл

После инкубации

проба с йодом

реакция Троммера

1.

Крахмал

Вода




Не делать

2.

Крахмал

Амилаза




Не делать

3.

Крахмал

Сахараза




Не делать

4.

Сахароза

Вода

Не делать




5.

Сахароза

Амилаза

Не делать




6.

Сахароза

Сахараза

Не делать



Содержимое перемешивают и пробирки помещают в термостат при 37-38 С на 20 мин. После инкубации с пробирками № 1, 2 и 3 , где в качестве субстрата был крахмал, проводят пробу с йодом, с другими (№ 4, 5, 6), где в качестве субстрата была сахароза проделывают реакцию Троммера.



Реакция Троммера. К содержимому пробирок добавляют 2 мл раствора с массовой долей гидроксида натрия 10 %, при встряхивании по каплям раствор с массовой долей сульфата меди 5 % до появления неисчезающей мути гидроксида меди (II). Содержимое пробирок нагревают на водяной бане до изменения цвета. Появление желтого окрашивания, переходящего в красное, указывает на наличие восстанавливающих сахаров (глюкозы и фруктозы), которые в щелочной среде восстанавливают гидроксид меди (ІІ) в оксид меди (І), сами при этом окисляются до альдоновых кислот.

Результаты опыта вносят в табл. 9 и делают вывод о специфичности амилазы слюны и сахаразы из дрожжей.

РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; растворы с массовыми долями: крахмала 1 %, соляной (или серной) кислоты 10 %, сахарозы 1 %, гидроксида натрия 10 %, сульфата меди 5 %; водный раствор йода; слюна разбавленная 1:3; сахараза.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.



  1. Характеристика специфичности действия фермента.

  2. Чем обусловлена специфичность действия каждого фермента?

  3. К какому классу и подклассу относятся ферменты α-амилаза и сахараза?

  4. Как определить специфичность действия ферментов?

  5. Какую реакцию катализирует амилаза слюны?

  6. Какую реакцию катализирует сахараза и почему её называют β-фруктофуранозидазой?

  7. Как можно обнаружить продукты гидролиза крахмала? Назовите продукты и их окраску с йодом.

  8. Какой реакцией можно обнаружить продукты гидролиза сахарозы? В чем химизм этой реакции.

3.3. Сравнение действия неорганических катализаторов и ферментов


Ферменты отличаются от неорганических катализаторов исключительно высокой каталитической активностью в условиях нормальной температуры, рН и давления.

ХОД РАБОТЫ. В пять пробирок наливают по 3 мл раствора с массовой долей крахмала 1 %. В первую и пятую добавляют по 1 мл воды, во вторую – 1 мл вытяжки из солода, в третью и четвертую – по 1 мл раствора с массовой долей серной или соляной кислоты 10 %. Содержимое перемешивают встряхиванием и первые три пробирки ставят в термостат при 37-38 С, а четвертую и пятую – в кипящую водяную баню. Через 20 мин пробирки из термостата и водяной бани убирают, горячие охлаждают до комнатной температуры и в каждую добавляют по 3 капли водного раствора йода. Расщепление крахмала шло в тех пробирках, где содержимое окрашено в желтые, красные и фиолетовые тона. Записывают окраску содержимого каждой пробирки и на основании полученных результатов делают вывод о том, какие из исследованных веществ являются катализаторами и при какой температуре происходит их каталитическое действие. Результаты оформить в виде табл. 10.

Таблица 10

Сравнение действия неорганических катализаторов и ферментов




пробы


Субстрат, 2 мл

Катализатор, 1 мл

Температура инкубации, ˚С

Окраска с йодом

1.

Крахмал

Вода

37-38




2.

Крахмал

Амилаза

37-38




3.

Крахмал

Кислота

37-38




4.

Крахмал

Кислота

100




5.

Крахмал

Вода

100



РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; растворы с массовыми долями: крахмала 1 %, соляной (или серной) кислоты 10 %; водный раствор йода; вытяжка из солода.


КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.

1. В каких пробирках отмечен гидролиз крахмала и какова его глубина?

2. Назовите катализаторы, которые осуществили гидролиз крахмала в данном опыте.

3. Назовите наиболее эффективный катализатор и объясните его преимущества.

4. Как влияла температура на активность небиологического катализатора и почему?

3.4. Факторы, влияющие на скорость ферментативных реакций (на активность ферментов)


Белковая природа обеспечивает ферментам характерные для белков строение и свойства и, прежде всего, лабильность, т.е. способность изменять активность в зависимости от различных факторов (температуры, рН, концентрации фермента и концентрации субстрата, активаторов и ингибиторов и т.п.). Степень изменения активности от различных факторов можно определить по скорости ферментативной реакции. Мерой скорости ферментативной реакции служит количество субстрата, подвергшегося превращению в единицу времени, или количество образовавшегося продукта. При изучении влияния какого-либо фактора на скорость ферментативной реакции все прочие факторы должны оставаться неизменными и по возможности иметь оптимальные значения.
ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА СКОРОСТЬ

ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ (на активность ферментов)


Скорость ферментативной реакции зависит от температуры. Оптимальным считается то значение ее, при котором реакция протекает с максимальной скоростью. Для большинства ферментов, выделенных из организма теплокровных и многих микроорганизмов оптимальная температура составляет 37-40 С, для ферментов растительного происхождения – 40-50 ˚С. Повышение температуры сверх оптимальной приводит к уменьшению, а затем прекращению действия фермента, что связанно с денатурацией. При переходе от оптимальной к низким температурам скорость ферментативной реакции падает в 2-2,5 раза на каждые 10 ˚С, достигая минимальной величины при 0 С и приостанавливается при отрицательных её значениях (минус 18 ˚С). Причиной является снижение скорости движения молекул субстратов и ферментов, что замедляет образование фермент-субстратного комплекса и проведения реакции. При повышении температуры от отрицательных значений действие ферментов восстанавливается, скорость катализируемых реакций возрастает в 2-2,5 раза на каждые 10 ˚С, до оптимальной температуры. Принцип снижения активности ферментов при понижении температуры используется при консервировании сырья и готовой продукции низкими температурами. Инактивация ферментов высокой температурой необратима, используется в пищевой промышленности для консервирования многих продуктов растительного и животного происхождения.

ХОД РАБОТЫ. В штативе располагают двумя рядами 8 пробирок (по 4 пробирки в ряду). Во все пробирки одного ряда наливают по 3 мл раствора крахмала; во все пробирки другого ряда по 0,5 мл вытяжки из солода. Первые пробирки из обоих рядов (одна с ферментом, другая с крахмалом) помещают в кипящую водяную баню, вторые – в термостат при 37-38 С, третьи – в лед или снег, четвертые оставляют при комнатной температуре. Через 10 мин содержимое каждой пары пробирок объединяют вместе (приливают крахмал к ферменту), перемешивают и пробирки с содержимым оставляют в тех же условиях. Этот момент считать началом опыта.

Не теряя времени, берут 3 чистые пробирки, вносят в них по 0,5-1 мл воды и по 3 капли раствора йода. Эти пробирки нужны для наблюдения за ходом гидролиза крахмала амилазой по реакции с йодом.

По истечении 2-5 мин инкубации из пробирки, стоящей при комнатной температуре, отбирают 0,2-0,3 мл инкубируемой смеси и вносят ее в одну из пробирок с раствором йода. Если появляется синее или фиолетовое окрашивание, то все пробирки оставляют в тех же условиях еще на 5 мин. После истечения этого времени реакцию с йодом повторяют. В случае появления красных тонов окраски содержимого пробирки, стоящей при комнатной температуре, инкубацию прекращают. Сразу же все пробирки собирают в штатив и в каждую добавляют по 1 мл раствора с массовой долей серной (или соляной) кислоты 10 % и по 3 капли раствора йода, содержимое перемешивают.

Глубину гидролиза крахмала определяют по окраске с раствором йода, результат записывают в следующую таблицу.

Таблица 11

Влияние температуры на активность ферментов


Температура

инкубации, С



Окраска с

йодом


Название обнаруженных на основании окраски продуктов

0







18-22







37-38







100







На основании полученных данных строят график зависимости скорости ферментативной реакции от температуры. При построении графика по оси ординат, начиная от нуля, обозначить цвета в следующей последовательности: синий, фиолетовый, красный (объединяя все его тона), оранжевый, желтый; по оси абсцисс – температуру, обозначив разрыв между 40 и 100 С. Записать принцип метода и сделать выводы.

РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; вытяжка из солода; раствор йода в йодиде калия; растворы с массовыми долями: крахмала 1 %, серной (или соляной) кислоты 10 %.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.

1. Перечислите факторы среды, влияющие на активность ферментов (скорость ферментативной реакции).

2. Назовите оптимальные температуры для ферментов животного, растительного и микробного происхождения.

3. Как влияет снижение температуры, от оптимальной до 0˚С и ниже, на скорость ферментативной реакции. Чем можно объяснить влияние этого фактора?

4. Как влияет повышение температуры от минусовых значений до оптимальной, на скорость ферментативной реакции?

5. Как влияет повышение температуры от оптимальной до 70 ˚ С и выше, на активность фермента. Чем объясняется влияние этого фактора?

6. Какая температура, в исследовании, была оптимальной, и как Вы это установили?

7. При каких температурах в исследовании, амилаза «не работала». Как Вы это установили? Объясните влияние этих факторов?

8. Практическое использование знаний о влиянии температуры на активность ферментов.
ВЛИЯНИЕ рН НА СКОРОСТЬ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ
Ферменты при постоянной температуре работают наиболее эффективно в пределах рН (от 2 до 10) . Оптимальным считается то значение рН, при котором реакция протекает с максимальной скоростью. Отклонение в любую сторону от этого значения сопровождается снижением скорости ферментативной реакции. Это объясняется тем, что ферменты имеют большое число полярных, положительно и отрицательно заряженных групп, участвующих в поддержании нативной конформации, образовании фермент-субстратного комплекса и проведении реакции.

Во многих случаях субстраты являются электролитами, и реакция осуществляется лишь с определенными (ионизированными или неионизированными) их формами, возникающими при оптимуме рН.

Многие ферменты являются двухкомпонентными (сложными белками), небелковый компонент которых слабо связан с белком ионными, водородными связями в условиях оптимума рН. Сдвиги рН за пределы оптимума вызывают диссоциацию кофактора и разрушение структуры активного центра. Например, пероксидаза диссоциирует в кислой среде на два компонента, однако при рН 7,0 её структура и активность восстанавливаются.

При очень низких и очень высоких значениях рН ферменты денатурируют.

ВЛИЯНИЕ рН НА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ
ХОД РАБОТЫ. Перед началом работы определяют активность амилазы слюны. Для чего в пробирке смешивают 2 мл раствора с массовой долей крахмала 1 % и 0,5 мл разбавленной 1:9 и профильтрованной слюны. Смесь оставляют при комнатной температуре. Наблюдение за ходом гидролиза крахмала проводят по реакции с раствором йода. Для чего каждые 5 мин отбирают по 3-4 капли гидролизата и вносят его в пробирку с заранее налитыми туда 0,5 мл воды и 3 каплями раствора йода. При появлении красно-бурой или красной окраски наблюдение прекращают. Желательно, чтобы гидролиз крахмала до эритродекстринов (красные тона окраски) происходил приблизительно за 1015 мин. Если гидролиз идет быстрее, то слюну нужно разбавить еще в 2 раза и опыт повторить. Найденное разбавление слюны используют для работы.

Нумеруют 5 пробирок и в каждую вносят по 4 мл буферного раствора с конкретным значением рН: 4,56; 5,72; 6,80; 7,96; 8,95 или близкими к каждому из этих значений. Пипетки после внесения каждого буферного раствора промывают. Во все пробирки добавляют по 2 мл раствора с массовой долей крахмала 1 % и по 0,5 мл разбавленной слюны. Содержимое перемешивают и пробирки оставляют при комнатной температуре. Наблюдение за ходом гидролиза крахмала ведут по реакции с раствором йода согласно методике, описанной на с. 42. Отбор проб производят из пробирки № 3 через каждые 5 мин. При появлении красного или желтого окрашивания содержимого сразу же во все пробирки вносят по 1 мл раствора с массовой долей соляной (или серной) кислоты 10 % и по 3 капли раствора йода. Содержимое перемешивают, результат вносят в табл. 12.

Таблица 12

Влияние рН на активность амилазы слюны




Показатели

Номера пробирок

1

2

3

4

5

рН *

4,56

5,72

6,80

7,96

8,95

Окраска с йодом
















__________

* При оформлении работы записать значения рН, указанные на флаконах.

По результатам работы построить график зависимости активности амилазы слюны от рН и сделать вывод. Порядок построения графика описан в предыдущей работе. Записать принцип метода.


ВЛИЯНИЕ рН НА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ СОЛОДА.
ХОД РАБОТЫ. Нумеруют 5 пробирок и в каждую вносят по 4 мл буферного раствора со следующими значениями рН: 2,87; 4,10; 5,33; 6,59; и 7,96 или близкими к каждому из этих значений. Пипетки после внесения каждого буферного раствора промывают. Во все пробирки добавляют по 2 мл раствора крахмала и по 0,5 мл вытяжки из солода. Содержимое перемешивают и в дальнейшем поступают точно так же, как описано на с. 42. Результат оформить в виде таблицы.

Таблица 13

Влияние рН на активность амилазы солода


Показатели

Номера пробирок

1

2

3

4

5

рН *

2,87

4,10

5,33

6,59

7,96

Окраска с йодом
















____________

* При оформлении работы записать значения рН, указанные на флаконах.
Записать принцип метода, построить график глубины гидролиза крахмала амилазой солода в зависимости от рН.

РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; раствор йода в йодиде калия; вытяжка из солода; слюна разбавленная 1:9 (фильтрованная); растворы с массовыми долями: крахмала 1 %, серной (или соляной) кислоты 10 %; растворы для приготовления смесей с заданными значениями рН (раствор № 1 с рН 1,81: в колбе вместимостью 1 л растворяют 0,04 моль борной кислоты, 0,04 моль фосфорной кислоты, 0,04 моль уксусной кислоты; раствор № 2: представляет собой раствор с концентрацией гидроксида натрия 0,2 моль/л). Буферные растворы нужных значений рН готовят смешение раствора № 1 и раствора № 2 в соответствии с табл. 14.

Таблица 14

Составление буферных растворов




Для амилазы слюны

Для амилазы солода

Раствор, мл

рН

Раствор, мл

РН

№ 1



№2

№ 1

№ 2

100,0

30,0

4,56

100,0

17,5

2,86

100,0

40,0

5,72

100,0

25,0

4,10

100,0

50,0

6,80

100,0

37,5

5,33

100,0

60,0

7,96

100,0

47,5

6,59

100,0

67,5

8,95

100,0

60,0

7,96

После смешения фактическое значение рН определить на рН-метре, добавлением раствора № 1 или № 2 максимально приблизить к заданной величине и написать на флаконе.


КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.

1. Как определить изменение активности амилазы под влиянием рН?

2. Характеристика оптимальных рН и её параметры для амилазы солода и слюны.

3. Каковы физико-химические основы влияния оптимальной рН на активность ферментов?

4. Каковы физико-химические основы влияния на активность ферментов сдвига рН от зоны оптимума в любую сторону?

5. Практическое применение знаний о влиянии рН на скорость ферментативных реакций и процессов.


3.5. Выделение α- и β- амилаз из солода и определение их активности

В солоде (проросшем зерне пшеницы, ржи, ячменя) содержатся активные α- и β- амилазы. Они хорошо растворяются в воде, поэтому их можно получить в виде водной вытяжки.

Выделение α- и β- амилазы из солодовой водной вытяжки основано на различной устойчивости этих ферментов к температуре и рН среды. При нагревании солодовой вытяжки до 70 ºС β-амилаза денатурирует, тогда как α-амилаза при этой температуре сохраняет нативную конформацию и активность. Оптимум действия β-амилазы проявляется при рН 4,8, однако α-амилаза при таких значениях рН теряет свою активность, а при понижении до рН 3,3 – денатурирует.
ВЫДЕЛЕНИЕ α-АМИЛАЗЫ. В пробирку вносят 5 мл солодовой вытяжки, содержащей активные α- и β-амилазы, добавляют на кончике ножа порошок ацетата кальция и пробирку выдерживают в течении 15 мин. на водяной бане, нагретой до 68 ºС (в период нагревания температура воды не должна подниматься выше 70 ºС и опускаться ниже 66 ºС). Затем содержимое пробирки охлаждают холодной водой. При таком прогревании β-амилаза полностью инактивируется, а α-амилаза сохраняет свою активность. Полученный раствор используют для определения активности α-амилазы.
ВЫДЕЛЕНИЕ β-АМИЛАЗЫ. В колбу вместимостью 50 мл вносят 5 мл солодовой вытяжки, содержащей активные α- и β-амилазы, добавляют 4 мл воды, 1 мл раствора с концентрацией соляной кислоты равной 0,1 моль/л (рН полученной смеси должен быть 3,3). Затем колбу с содержимым помещают на 15 мин на снег или лед (можно в морозильную камеру холодильника). В этих условиях α-амилаза полностью инактивируется, а β-амилаза сохраняет свою активность. По истечении 15 мин выдержки на холоде к содержимому колбы добавляют 2 мл раствора с концентрацией гидрофосфата натрия (Na2HPO4) 0,15 моль/л для того, чтобы рН довести до 6,0. Полученный раствор используют для определения активности β-амилазы.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АМИЛАЗ СОЛОДА

(по массе гидролизованного крахмала)

Действие амилаз на крахмал можно установить либо по убыли крахмала, либо по накоплению продуктов его распада – сахара.

Метод определения активности амилаз по массе расщепленного крахмала получил название колориметрического.

Принцип метода состоит в том, что активность амилаз рассчитывают по разности между массами взятого для опыта и оставшегося по окончании опыта нерасщепленным крахмала, определяемого фотометрическим анализом по цветной реакции с йодом. При проведении опыта продолжительность инкубации и объем раствора ферментного препарата устанавливают такими, чтобы в опытных пробирках (содержащих фермент) не произошел полный гидролиз крахмала.

Данный метод позволяет установить специфичность и активность совместного действия амилаз на крахмал. α-Амилаза (КФ 3.2.1.1.) гидролизует в крахмале и родственных полисахаридах α-1,4-гликозидные связи без определенного порядка. В результате образуются декстрины и незначительное количество мальтозы. β-Амилаза (КФ 3.2.1.2.) гидролизует в крахмале и родственных полисахаридах α-1,4-гликозидные связи, последовательно отщепляя молекулы мальтозы с нередуцирующих концов цепочек.

Наиболее эффективно гидролиз осуществляется под действием комплекса амилаз, содержащихся в вытяжке из солода.

ХОД РАБОТЫ. Для проведения опыта берут 6 пробирок, одна из них контрольная. Пробирки заполняют в соответствии с табл. 15.

Таблица 15

Определение активности амилаз солода




№ пробы

Компоненты, мл

Пробирки




1

2

3

4

5

6

1.

Вытяжка из солода

-

0,1

0,2

-

-

-




2.

α-Амилаза

-

-

-

0,2

0,4

-




3.

β-Амилаза

-

-

-

-

-

1,0




4.

Вода

1,0

0,9

0,8

0,8

0,6

-




5.

Буфер, рН 5,5

3,0

3,0

3,0

3,0

3,0

3,0




6.

Крахмал, 2%

3,0

3,0

3,0

3,0

3,0

3,0







Разбавление, R

-

10

5

5

2,5

2,4



Содержимое в пробирках перемешивают и ставят в термостат при 37-38 ºС на 30 мин. Такая постановка опыта позволяет одновременно определить суммарную активность амилаз в солодовой вытяжке (α- и β-амилаз вместе), активность α-амилазы и активность β-амилазы. По окончании времени инкубации пробирки из термостата вынимают и в каждую немедленно добавляют по 2 мл раствора с концентрацией соляной кислоты 1моль/л и по 3 капли водного раствора йода; содержимое перемешать.

Пробирки с содержимым, окрашенным в желтые тона, убирают. Пробирки с содержимым, окрашенным в синие, фиолетовые или красные тона оставляют для дальнейшей работы (если после добавления раствора йода все пробирки с одним и тем же ферментным препаратом будут окрашены в желтый цвет, то опыт следует повторить, взяв этот ферментный препарат в меньшем количестве).

Берут мерные колбы вместимостью 50 мл, нумеруют их соответственно номерам, оставленных для дальнейшей работы пробирок. В каждую колбу вносят 30-40 мл воды, 0,5 мл раствора с концентрацией соляной кислоты 1моль/л, 10 капель водного раствора йода и 0,5 мл смеси из пробирки в соответствии с номером колбы. Непосредственно перед отбором смеси содержимое пробирки перемешивают. Содержимое колбы доводят до метки водой, перемешивают и колориметрируют на ФЭКе при красном светофильтре против воды.

Активность амилаз выражают в мг расщепленного крахмала на 1г солода (или другого материала) за 1 мин. Расчет производят следующим образом:


  • определяют массу расщепленного крахмала по формуле:

Ек – Ео

m = • С,

Ек

где, m – масса расщепленного крахмала за время опыта, мг;

Ек – оптическая плотность контрольного раствора;

Ео – оптическая плотность опытного раствора;

С – масса внесенного крахмала, мг (3 мл раствора с массовой долей крахмала 2 % содержат 60 мг крахмала);

- полученный результат умножают на разбавление (см. табл. 15), т.е. приводят к 1 мл исходной ферментной вытяжки и затем делят на время инкубации (30 мин), что позволяет выразить активность амилазы в мг расщепленного крахмала 1 мл ферментной вытяжки за 1 мин.

Зная методику приготовления вытяжки из биологического объекта, можно легко рассчитать активность амилазы в мг расщепленного крахмала на 1 г биологического материала за 1 мин по формуле:

(Ек – Ео)• 60 •V

А = ,

Ек• V1• m• 30

где, А – активность амилазы в мг расщепленного крахмала на 1г солода (или другого материала) за 1мин;

Ек – оптическая плотность контрольного раствора;

Ео – оптическая плотность опытного раствора; 60 – масса взятого для анализа крахмала, мг (в 3 мл 2 % раствора содержится 60 мг крахмала);

V – общий объем солодовой вытяжки, полученной из солода (100 мл);

V1 – объем ферментного препарата, взятого для инкубирования, мл;

30 – время инкубации, мин;

m – масса солода, взятого для приготовления солодовой вытяжки.
При расчете активности β-амилазы в числитель необходимо ввести число 2,4, которое учитывает все разведения солодовой вытяжки, сделанные при выделении β-амилазы.

Результаты исследований записывают и делают выводы об активности амилаз солода.

РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; вытяжка из солода (приготовление см. с. 38); ацетатный буфер pH 5,5 (к 57,4 мл раствора с концентрацией уксусной кислоты 1 моль/л добавляют 50 мл раствора с концентрацией гидроксида натрия 1 моль/л и общий объем доводят водой до 500 мл); раствор с массовой долей крахмала 2 % (суспензируют 2 г растворимого крахмала в 20мл холодной воды, затем при помешивании добавляют 80 мл кипящей воды и кипятят 1 мин, после охлаждения объем доводят водой до 100 мл и содержимое перемешивают); раствор с концентрацией соляной кислоты 1 моль/л; раствор с массовой долей йода 0,3 % в растворе с массовой долей йодида калия 3 % (0,3 г йода кристаллического и 3 г йодида калия смешивают с 3-5 мл воды и после растворения йода объем доводят водой до 100 мл).
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.

1. Общая характеристика солода.

2. Какие ферменты содержатся в солоде и как их можно выделить?

3. Техника выделения α-амилазы. На чем она основана?

4. Метод выделения β-амилазы, на чем он основан?

5. Специфичность действия и активность α-амилазы.

6. Специфичность действия и активность β-амилазы.

7. Принцип колориметрического метода определения активности амилаз? Что положено в основу?

8. Расчет активности и характеристика полученных результатов.

3.6. Определение активности амилаз по Вольгемуту


Метод основан на нахождении максимального разведения жидкости, содержащей амилазу (вытяжка из солода, слюна, молоко, сыворотка крови и др.), при котором в стандартных условиях происходит полное расщепление определенного количества крахмала.

ХОД РАБОТЫ. В штатив устанавливают и нумеруют 7 пробирок и в каждую вносят по 1 мл воды. Затем в первую пробирку добавляют 1 мл вытяжки из солода, тщательно перемешивают и 1 мл смеси из пробирки 1 переносят в пробирку 2. Содержимое тщательно перемешивают и 1 мл смеси из пробирки 2 переносят в пробирку 3 и т.д. Из последней пробирки 1 мл смеси после перемешивания выливают. Таким образом, получается ряд разведений, в котором содержание солодовой вытяжки в каждой следующей пробирке в 2 раза меньше, чем в предыдущей.

После этого в каждую пробирку вносят по 2 мл раствора с массовой долей крахмала 1 % и содержимое перемешивают встряхиванием. Все пробирки помещают в термостат при 37-38 С на 30 мин. По окончании инкубации в каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора с массовой долей серной кислоты 10 % (для остановки реакции) и по 3 капли водного раствора йода. Результат опыта вносят в табл. 16, обозначая окраску первыми буквами образовавшегося цвета раствора.

Таблица 16

Окраска проб с йодом после инкубации






Номера пробирок и доля солодовой вытяжки в содержимом, мл

1

2

3

4

5

6

7

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128

Окраска раствора





















Отмечают, в каких пробирках произошел полный гидролиз крахмала (желтое окрашивание с йодом) и по последней из них рассчитывают активность амилазы (амилазное число). Допустим, полный гидролиз взятого для опыта крахмала произошел в 1, 2, 3 и 4 пробирках, следовательно, активность амилазы нужно считать по пробирке 4, в которой доля солодовой вытяжки составляет 1/16 мл. Пересчитав объем расщепленного крахмала на 1 мл солодовой вытяжки, получим число 32. Это означает, что 1 мл неразбавленной солодовой вытяжки в таких же условиях может расщепить 32 мл раствора с массовой долей крахмала 1 %, т.е. амилазное число составляет 32.

При определении амилазной активности молока кратность разведения уменьшают в 8-10 раз, время инкубации увеличивают до 60 мин, для исследования применяют раствор с массовой долей крахмала 0,1 %.

РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; водная вытяжка из солода; растворы с массовыми долями: крахмала 1 % (суспендируют 1 г растворимого крахмала в 10 мл холодной воды, затем при помешивании добавляют 90 мл кипящей воды и кипятят 1 мин, охлаждают, доливают водой до 100 мл и перемешивают), серной кислоты 10 % (60,6 мл концентрированной серной кислоты влить в 0,5 л воды и разбавить в мерной колбе до 1 л) или соляной кислоты 10 % (236 мл концентрированной соляной кислоты влить в 0,5 л воды и разбавить в мерной колбе до 1 л); водный раствор йода.


КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.

1. Принцип метода определения активности амилазы по Вольгемуту?

2. Техника получения разведений раствора амилаз.

3. Как определить максимальное разбавление амилазы, осуществившей полный гидролиз крахмала?

4. Расчет активности амилазы по Вольгемуту.

3.7. Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов


Активность ферментов, помимо температуры и рН, в значительной степени зависит от наличия и концентрации в реакционной среде некоторых ионов и соединений. Одни из них усиливают активность ферментов – активаторы, другие действуют угнетающе – ингибиторы. Одни из регуляторов – активаторы, присоединяясь к молекуле неактивного или малоактивного фермента, увеличивают активность до максимальной. Эту функцию часто выполняют ионы металлов: калия, кальция, магния, цинка, меди, железа, марганца, кобальта и анион хлора. Ряд протеиназ (катепсины, папаин), аргиназа активируются молекулами цистеина, восстановленного глютатиона, имеющих свободную НS-группу.

Нарастание активности ферментов под действием металлов объясняется тем, что в одних случаях ионы металлов выполняют роль кофакторов, в других – облегчают образование фермент-субстратного комплекса, в третьих – способствуют присоединению кофермента к апоферменту, в четвертых обеспечивают стабилизацию третичной и четвертичной структуры фермента.

Вещества, вызывающие частичное или полное торможение ферментных реакций, называют ингибиторами. К таким веществам относятся соли и ионы тяжелых металлов, дубильные вещества и др.

Ключевые (регуляторные) ферменты имеют аллостеричский центр для присоединения активаторов и ингибиторов, которые, присоединившись, вызывают обратимое изменение в структуре активного центра. Аллостерические ферменты выполняют важную роль в регуляции процессов метаболизма. Установлено, роль активаторов чаще всего в этом случае выполняют молекулы собственного субстрата, когда их концентрация в среде достигает определенного уровня, а также АМФ и некоторые гормоны. В ряду ингибиторов для этих ферментов обнаружены неорганические соли, некоторые гормоны, конечный или промежуточный продукт многостадийного процесса распада или синтеза часто служит аллостерическим ингибитором одной из первых реакций (так называемое ингибирование по типу обратной связи).


ХОД РАБОТЫ. В качестве источника фермента используют для работы вытяжку из солода.

В штативе располагают тремя рядами 18 пробирок (6 пробирок в каждом ряду). Пробирки каждого ряда нумеруют и во все вносят по 1 мл воды. Затем в первую пробирку каждого ряда добавляют по 1 мл вытяжки из солода, содержимое хорошо перемешивают. Далее производят разбавление фермента так же, как в работе 3.6.

После разбавления во все пробирки первого ряда наливают по 1 мл воды (контрольный ряд), в пробирки второго ряда – по 1 мл раствора с массовой долей хлорида натрия 1 % и в пробирки 3-го ряда – по 1 мл раствора с массовой долей сульфата меди 1 %. Затем во все пробирки приливают по 1 мл раствора с массовой долей крахмала 1 % в следующем порядке: сначала в первые пробирки всех рядов, после этого во вторые пробирки всех рядов и т.д. Содержимое перемешивают встряхиванием и штатив с пробирками ставят в термостат при 37-38С на 30 мин. По окончании инкубации в пробирки каждого ряда добавляют по 1 мл раствора с массовой долей серной (или соляной) кислоты 10 % и по 3 капли раствора йода в том же порядке, в каком приливался раствор крахмала. Содержимое перемешивают и отмечают в каждом ряду номер пробирки, в которой реакция на крахмал отрицательная (желтое окрашивание). Результаты опыта заносят в таблицу, обозначив желтые тона буквой «Ж», красные (красно-коричневые) – «К», фиолетовые – «Ф» и синие –«С». Таблица 17

Окраска проб с йодом после инкубации




Компоненты

Номера пробирок и доля вытяжки из солода в содержимом, мл

1

2

3

4

5

6

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

Вода



















Хлорид натрия



















Сульфат меди


















Определяют активатор и ингибитор. Разделив степень разведения контрольной пробы (первый ряд), в которой реакция с йодом отрицательная, на степень разведения проб, давших отрицательную реакцию с исследуемыми веществами, находят во сколько раз активатор или ингибитор стимулирует или тормозит действие амилазы. При высокой активности амилазы солода число пробирок в опыте увеличивают до 7-8.

РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; вытяжка из солода; растворы с массовыми долями: крахмала 1 %; хлорида натрия 1 %; сульфата меди 1 %; серной (или соляной) кислоты 10 %; раствор йода в йодиде калия.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.

1. Общая характеристика регуляторов ферментов.

2. Характеристика строения и действия активаторов.

3. Химическая природа и механизм действия ингибиторов.

4. Характеристика аллостерических (ключевых) ферментов и их роли в регуляции процессов метаболизма.

5. Схема опыта «Действие некоторых ионов на активность амилаз солода».

6. Каким методом, в этом опыте, определяли активность амилаз солода?

7. Какие соединения в опыте были активаторами и ингибиторами. Объясните механизм их действия.


3.8. Определение активности каталазы



(по А.Н. Баху и А.И. Опарину)


Оксидоредуктазы – класс ферментов катализирующих окислительно-восстановительные реакции. Окисление мономеров, образующихся в процессе катаболизма полимеров, представляет собой сложный многоступенчатый процесс.

Окисление веществ в клетках протекает, в основном, путем отщепления водорода (дегидрированием) или отщеплением электронов или путем присоединения кислорода к молекуле окисляемого соединения.

Акцепторами водорода у дегидрогеназ является НАД+, НАДФ, ФАД и ФМН, у некоторых флавиновых – кислород (их называют оксидазами), у гемсодержащих (пероксидаз и каталазы) – Н2О2 (пероксид водорода).

Акцепторами и переносчиками электронов являются цитохромы, содержащие гем (гемопротеины).

Каталаза (КФ 1.11.1.6) относится к гемопротеинам, катализирует процесс разрушения ядовитого для клеток пероксида водорода на воду и кислород: 2 H2O2 = 2 H2O + O2.

Для живой клетки пероксид водорода является сильным ядом, поэтому все ферменты образующие и обезвреживающие Н2О2 находятся в пероксисомах – органеллах покрытых мембраной. Главными потребителями Н2О2 являются пероксидазы (КФ 1.11.1.7.), которые окисляют фенолы, амины, некоторые гетероциклические соединения и др. субстраты дегидрированием, переносят снятые с субстратов [2Н] на Н2О2, восстанавливая его до 2 Н2О. Молекулы пероксида водорода, невостребованные пероксидазами, обезвреживаются каталазой.



Метод определения активности каталазы основан на определении количества пероксида водорода, расщепленного в процессе инкубации с ферментом. Количество H2O2 в реакционной смеси определяют титрованием в кислой среде раствором с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л:
5 H2O2 + 2KMnO4 + 3H2SO4 = 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 +8H2O
На основании приведенного уравнения реакции можно рассчитать, что 1 мл раствора с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л соответствует 1,7 мг (50 мкмоль) пероксида водорода.

ХОД РАБОТЫ. 2-3 г сырого картофеля (или другого свежего растительного материала) тщательно растирают в ступке с кварцевым песком или стеклом. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике скальпеля CaCO3 до прекращения выделения пузырьков СО2. В процессе растирания в ступку добавляют небольшими порциями 40-50 мл воды. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят водой до метки и перемешивают. Смесь оставляют стоять 10-15 мин и после перемешивания фильтруют.

Берут две конические колбочки вместимостью 150-200 мл и вносят в них по 20 мл полученного фильтрата. Содержимое одной колбы кипятят в течение 1 мин и охлаждают до комнатной температуры (контроль). Другая колба опытная содержит активный фермент. К содержимому опытной и контрольной колб приливают по 20 мл воды и по 3 мл раствора с массовой долей H2O2 1 %. Содержимое тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. По окончании инкубации в обе колбы добавляют по 5 мл раствора с массовой долей серной кислоты 10 %, перемешивают и избыток H2O2 в каждой колбе оттитровывают раствором с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л до образования розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин.

Активность каталазы выражают в мкмоль пероксида водорода, расщепившегося под действием фермента в расчете на 1 г исследуемого материала (или на 1 мг вытяжки из него) за 1 мин. Вычисление ведут по формуле:



,
где Х – активность каталазы, Е/г;

(а-b) – разность между объемами раствора с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л, пошедшего на титрование контрольной (а) и опытной (b) проб, мл;

Т – титр примененного для титрования раствора перманганата калия;

50 – коэффициент пересчета на мкмоль H2O2;

100 – общий объем приготовленного экстракта;

m – масса взятого для анализа материала, г;

20 – объем фильтрата, взятого для анализа, мл;

30 – время инкубации, мин.


Принцип определения, порядок анализа и результат анализа записывают.

Активность каталазы можно определить и по объему кислорода, выделившегося после прибавления к исследуемому объекту H2O2.

Этот принцип используют для определения активности каталазы в молоке, выражаемую каталазным числом, представляющим собой объем кислорода (мл) выделившийся за 2 часа при 25 С из добавленных к 15 мл молока 5 мг раствора с массовой долей H2O2 1 %. Молоко, полученное от здоровых животных, выделяет 0,7-2,5 мл кислорода, т.е. каталазное число натурального молока составляет не более 2,5. Молоко, полученное от больных животных (мастит и др.), и молозиво имеют повышенные каталазные числа, достигающие до 15.

РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; кальций углекислый (порошок); раствор с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л; растворы с массовыми долями: пероксида водорода 1 % (10 мл раствора с массовой долей H2O2 30 % разбавить водой до 300 мл), серной кислоты 10 %.


КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.

1. Основные пути окисления субстратов в клетке.

2. Характеристика строения и действия НАД+- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ.

3. Характеристика строения и действия ФАД-зависимых дегидрогеназ.

4. Какие ферменты называют оксидазами? Их кофакторы.

5. Характеристика строения и действия пероксидаз и каталаз.

6. Характеристика строения и действия цитохромов.

7. Химизм, образование и пути обезвреживания пероксида водорода в клетках.

8. Метод определения активности каталазы.

Глава 4. Углеводы и их обмен


Углеводы – основной источник энергии для процессов жизнедеятельности человека, животных, растений и многих микроорганизмов. Кроме этого, метаболиты (промежуточные продукты обмена) углеводов служат материалом для синтеза многочисленных мономеров, а из мономеров – полимеров и других соединений.

В продуктах питания человека, в кормах животных углеводы представлены полисахаридами – крахмалом, гликогеном, клетчаткой, пектиновыми веществами и др., а также олиго- и моносахаридами: сахарозой, мальтозой, лактозой, глюкозой, фруктозой и др.

У растущих и развивающихся растений синтезируется резервный крахмал, который служит субстратом дыхания и источником метаболитов. В период созревания крахмал откладывается в плодах, клубнях, луковицах, семенах, зернах и служит запасным энергетическим материалом зародыша и источником многочисленных метаболитов.

Использование (мобилизация) полисахаридов начинается с их гидролиза амилазами или расщепления путем фосфоролиза ферментом фосфорилазой.


4.1 Действие амилазы на сырой и вареный крахмал


Податливость субстрата к действию фермента получила название атакуемости. Атакуемость крахмала амилазами зависит от степени повреждения структуры крахмального зерна. Неповрежденные или механически поврежденные крахмальные зерна довольно устойчивы к действию амилазы, оклейстеренный крахмал (вареный) расщепляется амилазами с большей скоростью.

Резервный крахмал семян, зерен злаковых и клубней гидролизуется только после набухания (обводнения).

ХОД РАБОТЫ. Берут две пробирки. В одну вносят 5 мл раствора оклейстеренного крахмала, в другую – 5 мл раствора сырого крахмала (содержимое флакона перед отбором пробы тщательно перемешивают). В каждую пробирку добавляют по 1 мл разбавленной (1:1) слюны или вытяжки солода. Содержимое перемешивают, и пробирки ставят в термостат на 20 мин при 37-38 С. По окончании инкубации в пробирки добавляют по 3 капли раствора йода, содержимое хорошо перемешивают и по результатам опыта делают вывод.

РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; раствор йода в йодиде калия; растворы с массовыми долями: оклейстеренного крахмала 2 %; сырого крахмала 2 %; слюна разбавленная 1:1; вытяжка из солода.


КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.

1. Назовите углеводы продуктов питания.

2. Роль углеводов для организма.

3. Углеводы растений, их роль.

4. Пути мобилизации полисахаридов в организме животных, растений и микроорганизмов.

5. Роль крахмала в зернах злаковых и развивающихся растениях.

6. Какие ферменты осуществляют мобилизацию крахмала и гликогена?

7. Действие амилаз на сырой и вареный крахмал.

8. Какой крахмал гидролизуется легче и почему?

8. Методы контроля (определения) активности амилаз.

9. Результаты определения скорости гидролиза сырого и вареного крахмала амилазами солода.

4.2. Анаэробное окисление углеводов


Основным источником энергии для клеток животных, растений и многих бактерий, является окисление глюкозы, протекающее в две стадии: анаэробную и аэробную.

Анаэробная стадия окисления глюкозы в клетках человека и животных получила название гликолиз. Гликолиз является первым, а в анаэробных условиях основным процессом катаболизма глюкозы, освобождающаяся при этом энергия аккумулируется в молекулах АТФ. Гликолиз протекает в цитоплазме, состоит из 10 реакций и условно делится на три фазы.

Первая – активирование глюкозы (пусковая реакция) и подготовка к расщеплению на две фосфотриозы; расщепление фруктозо-1,6-дифосфата и изомеризация дигидроксиацетонфосфата в глицеральдегид-3-фосфат.


Карта сайта

Последнее изменение этой страницы: 2018-09-09;



2010-05-02 19:40
referat 2018 год. Все права принадлежат их авторам! Главная