Апробация работы - Молекулярно-генетические маркеры риска генерализованного пародонтита и их применение в диагностике Апробация работы Публикации Структура и объем диссертации Учебный сайт
Учебные материалы


Апробация работы - Молекулярно-генетические маркеры риска генерализованного пародонтита и их применение в диагностике




Апробация работы


Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: Всероссийской конференции “Профилактика основных стоматологических заболеваний” (г. Москва, 2003); Российско - норвежском симпозиуме “Заболевания пародонта - актуальные проблемы” (г. Москва, 2004); X и XI Российском национальном конгрессе “Человек и лекарство” (г. Москва, 2003, 2004 гг); Втором съезде общества биотехнологов России (г. Москва, 2004); Всероссийском симпозиуме “Актуальные проблемы стоматологии”, Всероссийского конгресса “Современные методы профилактики и лечения заболеваний пародонта” (г. Уфа, 2004); Всероссийской научно-практической конференции - Первого Всероссийского стоматологического форума “Дентал Ревю” (г. Москва, 2004); II Всероссийской научно-практической конференции “Образование, наука и практика в стоматологии” (г. Москва, 2005); Второй и третьей научно-практической конференции “Актуальные проблемы медицинской биотехнологии” (г. Анапа, 2005, 2006); III Всероссийской научно-практической конференции “Образование, наука и практика в стоматологии” (г. Москва, 2006); Четвертом съезде общества биотехнологов России. (Москва, 2006); VIII международном конгрессе МАКМАХ/ASM по антимикробной терапии (г. Москва, 2006); IV Всероссийской научно-практической конференции “Образование, наука и практика в стоматологии” (г. Москва, 2007); совместном совещании кафедры микробиологии, иммунологии и вирусологии, лаборатории молекулярно – биологических исследований и лаборатории иммунологии НИМСИ ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава (протокол № 6 от 18 июня 2007 г.).

Публикации


По материалам диссертации опубликована 51 научная работа, в том числе 12 – в научных изданиях, рекомендованных ВАК МО РФ, учебные пособия – 3, руководство для студентов – 1, методические рекомендации МЗ и СР для врачей – 1; получено положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение; зарегистрирована медицинская технология № ФС-2006/043 – У.

Структура и объем диссертации


Диссертация построена по традиционному плану и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 385 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 94 рисунками и содержит 80 таблиц. Список литературы включает 72 отечественных и 350 иностранных источников.
Содержание работы
Материалы и методы исследования
В период с 2002 по 2007 годы нами проведено комплексное обследование 684 человек, обратившихся в пародонтологические отделения консультативно-диагностических центров при Московском государственном медико-стоматологическом университете. Из них 122 человека со здоровым пародонтом и 562 больных хроническим генерализованным пародонтитом (ХГП) в стадии обострения, в возрасте от 18 до 72 лет (360 женщин и 324 мужчины) и
давностью заболевания от 3 до 10 лет. На основании эпидемиологических, клинико-анамнестических и лабораторных данных были выделены 4 основные группы:

  1. пациенты с легкой степенью ХГП (77 человек),

  2. больные со средней степенью тяжести заболевания (281 человек),

  3. больные с тяжёлой степенью заболевания (204 человека),

контрольная группа - 122 человека со здоровым пародонтом.
По данным анамнеза, анкетирования и заключений общих специалистов у 473 (84 %) из 562 человек с ХГП выявлены сопутствующие заболевания. Сто девяносто (34 %) пациентов указали на наличие в анамнезе инфекций, вызываемых вирусами семейства Herpesviridae. Все обследованные люди не имели системных заболеваний (ревматоидного артрита, миастении gravis, шизофрении), ассоциированных с полиморфизмом генов IL - 1α, IL - 1β и HLA - системы.
Методическую основу работы составляло выявление в исследуемом материале из пародонтальных карманов больных ХГП и зубодесневой борозды людей со здоровым пародонтом некоторых представителей пародонтопатогенных видов бактерий и вирусов семейства Herpesviridae молекулярно-генетическими и бактериологическими методами, а также изучение полиморфизма генов IL - 1 и HLA – системы у обследованных людей. В качестве исследуемого материала при иммуногенетических исследованиях использовали эпителиальные клетки со слизистой щеки. ДНК выделяли из соскобов по методу Higuchi R. H. и Erlich H. (1989) c некоторыми модификациями. Реакции амплификации проводили на амплификаторе “Терцик MC2” («НПФ ДНК – технология», Россия) по программам, рекомендованным производителем набора. Маркерные пародонтопатогенные виды бактерий выявляли с помощью набора реактивов “Мультидент - 5”, разработанного нами совместно с сотрудниками фирмы ООО «НПФ “Генлаб”», для идентификации ДНК пяти видов пародонтопатогенов с помощью ПЦР и электрофореза в 1,6 % агарозном геле; тест-системы Micro DentR (“Hain Diagnostica”, Германия), позволяющей проводить мультиплексную ПЦР, с последующей регистрацией синтезированных ампликонов методом обратной гибридизации; и классического бактериологического исследования в анаэробных условиях (анаэростат «Himedia», Великобритания, газовая смесь – 80 % азота, 10 % углекислого газа, 10 % водорода). Идентификацию выделенных штаммов проводили на основании комплекса морфологических, культуральных и биохимических признаков. В частности, использовали тест-систему API An 20 (Франция).
Идентификацию ДНК Herpes simplex virus 1 и 2 типов (HSV 1,2), Human cytomegalovirus (CMV) и Epstein - Barr virus (EBV) проводили с помощью ПЦР, используя мультипраймерный набор реагентов “МультиГер - 3”, и набор реагентов для определения ДНК вируса простого герпеса 2 типа (ООО «НПФ “Генлаб”», Москва). Предварительно проводили иммуноферментное определение видоспецифических антител к цитомегаловирусу, вирусу простого герпеса 1, 2 и ядерному белку EBNA-1 p72 в сыворотке

периферической крови твёрдофазным методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью тест-систем Вектор-Бест, (РФ). Исследование полиморфизма генов IL - 1α и IL - 1β проводили с помощью GenoTypeR PRT теста (“Hain Diagnostica”, Германия). Принцип метода основан на DNA-STRIP технологии, позволяющей осуществлять комбинированный анализ основного состава и сочетание аллелей в локусе –889 IL - 1α и +3953 IL - 1-1β генов человека с помощью молекулярно-генетических методов.
Изучение полиморфизма генов HLA класса II (DRB1, DQA1, DQB1) проводили с помощью высокоразрешающего метода ДНК - типирования. Для этого применяли наборы реактивов HLA-ДНК-Тех («НПФ ДНК - технология», Россия), позволяющие выявлять 13 специфичностей гена HLA - DRB1, 8 аллелей гена HLA - DQA1 и 11 аллелей гена HLA - DQB1. Детекцию продуктов амплификации проводили в ультрафиолетовом свете после электрофореза в 3 % - ном арагозном геле. Распределение аллельных частот и генотипов вычисляли из процентного соотношения числа индивидуумов, обладающих определенным аллелем или генотипом, к общему числу индивидуумов в выборке.
Для определения частоты аллелей исследованных генов и их гаплотипов методом максимального правдоподобия использовали компьютерную программу “Арлекин” версия 2.1 (URL:http:/antro.unige.ch/arlequin). Достоверность различий в частоте встречаемости аллелей и гаплотипов рассчитывали с помощью критерия 2 с поправкой Йетса на непрерывность выборки. В необходимых случаях, когда в группе сравнения было менее 5 наблюдений, использовали двусторонний критерий Фишера. Наличие ассоциаций заболевания с генотипом оценивали по величине относительного риска (RR) с расчетом для него 95 % доверительного интервала (ДИ) и проверкой на достоверность (р) отличия RR по точному двустороннему тесту Фишера для четырехпольных таблиц с поправкой на количество выявленных аллелей (pcor) по методу Бонферони (Животовский Л.А., 1991).
Клиническое обследование включало выявление жалоб пациентов на болезненность и отёчность дёсен, неприятный запах изо рта, кровоточивость дёсен, оголение шейки зуба, расшатывание и выпадение зубов. Оценку состояния тканей пародонта проводили, используя упрощенный гигиенический индекс УИГ - OHI-S (Green J.C., Vermilion J.R., 1960); индекс кровоточивости десневой борозды ИК - SBI (Mühleman H.R., Son S., 1971); пародонтальный индекс ПИ - PI (Russel A.,1956). Глубину пародонтального кармана измеряли с помощью градуированного пуговчатого пародонтального зонда. Для уточнения клинического анализа всем больным назначали рентгенологическое исследование (Григорьян А. С. и др., 2004).
В исследовании были использованы следующие статистические методы и критерии: критерий хи-квадрат для проверки независимости признаков на основе таблицы сопряженности; метод главных компонент и факторный анализ для агрегирования исследуемых признаков; модель линейной регрессии для описания зависимости отклика Z от предикторов X, Y, … в виде линейной функции: Z = a + bX + cY + …; модель полиномиальной логистической регрессии с упорядоченным откликом для прогнозирования отклика, который принимает только целые значения, причем эти значения измеряются в порядковой шкале (Лагутин М. Б., 2007). Все расчеты проводили с помощью пакетов SPSS v15 for Windows и STATISTICA 7.0.
Результаты исследования и их обсуждение
Как следствие поставленных задач нами совместно с «НПФ ООО “Генлаб”» был разработан набор реагентов “Мультидент - 5” для определения ДНК пародонтопатогенных микробов Prevotella intermedia sensu stricto, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции.1 Предложенный набор включает комплект реагентов для пробоподготовки; комплект для амплификации, содержащий буфер, 5 прямые и 2 обратные праймеры, дезоксинуклеозидтрифосфаты, ДНК - полимеразу, положительный и отрицательный контрольные образцы, и комплект для анализа продуктов ПЦР. Принцип действия набора основан на выделении ДНК пародонтопатогенов с помощью комплекта I, амплификации фрагментов хромосомной ДНК (комплект II) и детекции продуктов ПЦР методом электрофореза в агарозном геле (комплект III). На этапе амплификации используют прямой олигонуклеотидный праймер (затравку), специфичный для фрагмента генома P. intermedia, прямой олигонуклеотидный праймер, специфичный для фрагмента генома B. forsythus, прямой олигонуклеотидный праймер, специфичный для фрагмента генома A. actinomycetemcomitans, прямой олигонуклеотидный праймер, специфичный для фрагмента генома P. gingivalis, общий для ДНК P. gingivalis, P. intermedia, A. actinomycetemcomitans и B. forsythus обратный олигонуклеотидный праймер, два олигонуклеотидных праймера, фланкирующие участок ДНК, специфичный для генома T. denticola. Положи-
тельный контрольный образец ДНК состоит из ДНК рекомбинантной плаз-
1 - решение о выдаче патента РФ на изобретение по заявке № 2005136997 от 21.01.2007.
миды с клонированным фрагментом размером 1000 п. н. генома P. intermedia sensu stricto, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 745 п. н. генома B. forsythus, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 512 п. н. генома T. denticola, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 360 п. н. генома A. actinomycetemcomitans, ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 197 п. н. генома Porphyromonas gingivalis.
Чувствительность набора составляет не более 104 копий/мл для каждого возбудителя, что обеспечивает возможность выявления бактерий в количествах, характерных для участков с риском развития или прогрессирования пародонтита и снижение расхода реагентов для амплификации. Специфичность набора была доказана экспериментально и проверена на клинических образцах.
В результате последующих исследований было показано, что предложенный набор реактивов позволяет одновременно, быстро, просто и точно идентифицировать в одной пробе 5 видов пародонтопатогенов, в том числе трудно культивируемые, с помощью одноступенчатой мультиплексной ПЦР (рис. 1).
М 1 2 3 4 5 6 7 8 К+

Примечание: К+ – положительный контроль, М – маркеры молекулярного веса ДНК. 1 - 6, 8 – положительные пробы, 7 – отрицательная проба.
Рис. 1 Электрофореграмма продуктов ПЦР в 1,6 % агарозном геле.
При изучении состава пародонтопатогенной микрофлоры у больных ХГП с помощью набора реактивов “Мультидент - 5”, тест - системы Micro Dent

R

(

Hain Diagnostica) и классическим культуральным методом было показано, что частота встречаемости разных видов пародонтопатогенных бактерий у больных с генерализованной формой пародонтита существенно различалась. В ассоциациях доминировали представители видов – P. intermedia, P. gingivalis, B. forsythus, Fusobacterium nucleatum, A. actinomycetemcomitans, T. denticola, Actinomyces naeslundii, A. israelii, Streptococcus intermedius, Peptostreptococcus micros. При этом можно было выявить существование нескольких этиологически разнородных вариантов пародонтита, не имеющих различий в клинической картине. Мы также апробировали “Мультидент - 5” при изучении видового состава микробов в исследуемом материале, полученном у пациентов с различными воспалительными заболеваниями ротовой полости и челюстно - лицевой области.
Получив новое диагностическое средство мы изучили видовой состав основных пародонтопатогенов и их ассоциаций с клиническими параметрами у больных ХГП и лиц со здоровым пародонтом. Только в контрольной группе обследованных нами людей был отмечен оптимальный уровень гигиены. При этом у 5 (4 %) из 122 человек со здоровым пародонтом была выявлена ДНК A. actinomycetemcomitans, у 1 (0,8 %) человека – P. intermedia, 4 (3 %) – B. forsythus, 2 (1,6 %) – T. denticola. P. gingivalis в норме не выявляли (рис.2). У 209 (37 %) из 562 больных ХГП выявили A. actinomycetemcomitans (ОШ = 14; ДИ: 23; 70), у 326 (58 %) – P. gingivalis (ОШ = 168; ДИ: 12; 330), у 263 (47 %) - P. intermedia (ОШ = 106; ДИ: 15; 220), у 352 (63 %) – B. forsythus (ОШ = 49; ДИ: 18;76), T. denticola – у 289 (51 %) пациентов (ОШ = 63; ДИ: 16; 260). Частота выявления всех пяти изученных нами видов микробов возрастала в зависимости от степени тяжести пародонтита от 40 раз у пациентов 1-й группы до 70 раз у пациентов 3-й группы по сравнению с контролем, р = 0,0001. Таким образом, шанс появления любого из данных пародонтопатогенов у пациентов с легкой, средней или тяжелой степенями ХГП значительно выше шанса их определения у представителей контрольной группы.

Рис. 2. Относительная частота выявления ДНК пародонтопатогенов в области зубодесневой борозды у больных ХГП и людей со здоровым пародонтом.
Следует отметить, что частота определения каждого из пяти изучаемых нами видов микробов была значительно ниже у пациентов с ХГП легкой степени, чем у больных со средней и тяжелой степенью заболевания. Разница в частоте выявления каждого из них у пациентов со средней и тяжелой степенями ХГП была статистически не достоверна. Тем не менее, отношения шансов для 3-й и 1-й групп варьировали в пределах от 1,9 до 2,6 при р < 0,05.
Всех пациентов можно было разделить на 31 подгруппу по наличию у них пародонтопатогенов (от полного отсутствия до одновременного выявления всех 5 видов микробов), в которые входили от 3 (0,5 %) до 62 (11 %) человек. Только у 54 из 562 (9,6 %) обследованных нами пациентов с ХГП не было выявлено ни одного вида микробов, тогда как в контрольной группе – у 112 (92 %) человек (pcor = 0,00031). Таким образом, вероятность отсутствия у больных ХГП изучаемых нами пародонтопатогенов в 10 раз ниже, чем у здоровых людей. Очень редко у пациентов с ХГП выявляли один вид пародонтопатогенов. Только P. gingivalis определили у 35 (6 %) человек с пародонтитом, при этом разница с контрольной группой была статистически достоверной при р = 0,0047 (ОШ = 8,4; ДИ: 1,2; 25). У 62 (11 %) пациентов с ХГП были одновременно выявлены 4 вида микробов - P. intermedia, B. forsythus, T. denticola и P. gingivalis (pcor = 0,0031), у 61 (10,9 %) – все 5 видов пародонтопатогенов (pcor = 0,00031). У 8 (6,6 %) человек контрольной группы в области зубодесневой борозды был выявлен один вид микробов и только у 2 (1,4 %) человек – два вида пародонтопатогенов.
Разницы в частоте выявления пародонтопатогенов у мужчин и женщин с ХГП не обнаружено. У курящих пациентов все изучаемые нами виды пародонтопатогенов выявляли в 1,4 – 1,7 раза чаще, чем у некурящих, р = 0,001.
В результате изучения связи некоторых ассоциаций пародонтопатогенов с пародонтальными индексами было установлено, что присутствие в области зубодесневой борозды

B. forsythus или ассоциаций бактерий T. denticola и B. forsythus; P. intermedia, B. forsythus и P. gingivalis; P. intermedia, B. forsythus, T. denticola и P. gingivalis или всех 5 видов бактерий статистически значимо связано с увеличением индекса ПМА на 3 - 7 %, глубины пародонтального кармана на 0,2 - 0,6 мм, пародонтального индекса – на 0,11 - 0,15 баллов, индекса кровоточивости (ИК) на 6 - 8 %, р = 0,001.
Одновременное присутствие в содержимом пародонтальных карманов P. intermedia, B. forsythus и P. gingivalis было связано с наибольшим увеличением средних значений пародонтального индекса у пациентов с ХГП с легкой, средней и тяжелой степенями заболевания. Наибольший прирост глубины пародонтальных карманов наблюдали у пациентов со средней степенью тяжести ХГП. Самое большое увеличение индекса ПМА было связано с наличием пяти видов пародонтопатогенов. Прирост средних значений был равен 8,4 %, р = 0,001. Увеличение индекса кровоточивости (ИК) на 6,3 % связано с появлением B. forsythus, р = 0,001.
Одним из наиболее важных признаков наличия у человека вторичного
иммунодефицита является присутствие в организме ГВ.
С помощью иммуноферментного анализа было установлено, что у 533 (95 %) обследованных больных, страдающих пародонтитом, в сыворотке крови содержались антитела класса IgG к HSV 1 или 2 типа, в 483 (86 %) случаев – антитела IgG класса к CMV и только у 29 (5 %) пациентов – антитела IgМ класса к CMV. Немногим более, чем у половины больных ХГП были выявлены антитела к ядерному белку EBNA-1 p72, являющегося маркером пастинфекции, в относительно небольших количествах: 2,19 у.е./мл (от 0 до 7,06 у.е./мл), что в 4 раза выше, чем у представителей контрольной группы – 0,51 у.е./мл (от 0 до 2,3 у.е./мл), рm.-u. = 0,0013. Причем у женщин их уровень был почти в 2 раза статистически значимо выше, чем у мужчин, а также у пациентов со средней и тяжелой степенями тяжести заболевания по сравнению с контролем. Полученные результаты указывали на наличие латентной полиинфекции и возможность реактивации инфекционных агентов у иммунокомпроментированных пациентов, с которыми может быть связано прогрессирование пародонтита.
С помощью ПЦР ДНК HSV 1 типа была выявлена у 91 (16 %), HSV 2 типа – 23 (4 %), CMV – 40 (7,1 %), EBV – 101 (18 %) пациента. В тоже время у здоровых людей в области зубодесневой борозды был выявлен генетический материал только HSV 1 типа в 3 (2,6 %) случаев и СMV – у 2 (1,7 %) обследованных индивидуумов. ДНК HSV 2 типа и EBV не выявлена ни у одного человека (рис.3).
При этом значения отношения шансов были выше “4,5” для всех вирусов. Относительная частота выявления вирусов в пародонтальных карманах возрастала в зависимости от тяжести заболевания. Так, генетические маркеры HSV 1 типа были выявлены у 8 % пациентов с легкой, 15 % − средней и 22 % − тяжелой стадиями ХГП. Маркеры CMV выявили у 5 (6,5 %) пациентов 1-й группы, 14 (5,2 %) – 2-й и 21 (10,3 %) человека 3-й группы. Чаще всего в пародонтальных карманах выявляли EBV. Его определили у 10 (13 %) пациентов 1-й группы, 40 (14 %) − 2-й и 51 (25 %) пациента − 3-й группы. Однако у большинства (от 74 % пациентов 1-й до 52 % в 3-й группе) вирусы не были выявлены. Одновременно два типа вирусов выявили не более, чем у 10 % пациентов. При этом относительная частота одновременного присутствия двух типов вирусов у пациентов 3-й группы статистически достоверно превышала частоту как у пациентов 1-й группы (р = 0,017), так и пациентов 2-й группы (р = 0,009).
4 5
Карта сайта

Последнее изменение этой страницы: 2018-09-09;



2010-05-02 19:40
referat 2018 год. Все права принадлежат их авторам! Главная