Міністерство освіти і науки, молоді та спорту україни ОдесЬкий нацІональнИй унІверситет Імені І.І. Мечникова Міністерство освіти і науки, молоді та спорту україни Учебный сайт
Учебные материалы


Міністерство освіти і науки, молоді та спорту україни ОдесЬкий нацІональнИй унІверситет Імені І.І. Мечникова



Дата02.05.2016өлшемі329.24 Kb.түріАвтореферат

  • Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
  • Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Ушакова Галина Олександрівна
  • Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Кучмеровська Тамара Муратовна
  • Хижняк Світлана Володимирівна
  • Апробація результатів дисертації.
  • Матеріали та методи досліджень.
  • РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ Зміни у мозку щурів за умов розвитку неалкогольного стеатогепатиту.
  • Розвиток печінкової енцефалопатії за умов експериментального хронічного гепатиту.
  • Особливості процесів взаємодій в комплексі нейрон-астроцит за умов печінкової енцефалопатії під час неалкогольного стеатогепатиту та хронічного гепатиту.
  • Вплив глутаргіну, цитофлавіну та альфа-кетоглутарату на розподіл нейрон- та астроцитспецифічних протеїнів за умов розвитку експериментального хронічного гепатиту
  • Кореляція розподілу нейрон- та астроцитспецифічних протеїнів та поведінки щурів за умов моделювання ХГ.
  • Зміни рівня S100b у сироватці крові щурів за умов розвитку хронічного гепатиту та застосування альфа-кетоглутарату та цитофлавіну.
  • СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
  • АНОТАЦІЯ Фоменко О.З. Вміст, тканинний розподіл та біохімічні властивості нейрон- та астроцит-специфічних протеїнів за експериментальної енцефалопатії. – Рукопис.
  • АННОТАЦИЯ Фоменко О. З. Содержание, распределение в тканях и биохимические свойства нейрон- и астроцит-специфических белков при экспериментальной энцефалопатии. – Рукопись.
  • SUMMARY Fomenko O. Z. The content, tissue distribution and biochemical properties of neuron- and astrocyte-specific proteins in experimental encephalopathy. – The manuscript.

:

202
202 -> Қазақстан республикасының 2020 жылға дейінгі стратегиялық даму жоспары
202 -> Кандидат социологических наук, профессор Московского государственного
202 -> ПӘннің ОҚУ-Әдістемелік материалдары
202 -> «Туған жер флорасы мен фаунасы» пәні бойынша тест сұрақтары
202 -> Шалғындық ҚОҢырбаспен шошқа мал басын азықтандыру
202 -> Динаміка світового ринку венчурного капіталу Загальносвітовий ринок
202 -> Ұсыну үшін құжаттар қабылдау мемлекеттік қызмет стандарты Жалпы ережелер
202 -> 1 межелік бақылауға арналған тестер
202 -> -

Міністерство освіти і науки, молоді та спорту україни



ОдесЬкий нацІональнИй унІверситет Імені І.І. Мечникова

ФОМЕНКО ОЛЬГА ЗІНОВІЇВНА

УДК 612.82-884 + 577.112

ВМІСТ, ТКАНИННИЙ розподіл ТА БІОХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ нейрон- та астроцит-специфічних білків ЗА експериментальнОЇ ЕНЦЕФАЛОПАТІЇ

03.00.04 – біохімія

Автореферат



дисертації на здобуття наукового ступеня



кандидата біологічних наук

Одеса – 2011

Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Дніпропетровському національному університеті імені

О. Гончара, Міністерство освіти і науки, молоді та спорту України




Науковий керівник:



доктор біологічних наук, професор

Ушакова Галина Олександрівна

,

Дніпропетровський національний університет імені О. Гончара

МОНмолодьспорту України,

професор кафедри біофізики та біохімії




Офіційні опоненти:



доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник



Кучмеровська Тамара Муратовна,

Інститут біохімії імені О. В. Палладіна НАН України, провідний науковий співробітник відділу біохімії вітамінів і коензимів





доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник



Хижняк Світлана Володимирівна

, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, провідний науковий співробітник Науково-дослідної лабораторії фізико-хімічної біології

Захист відбудеться 14 жовтня 2011 р. о 1300 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.051.06 в Одеському національному університеті імені І.І. Мечникова, за адресою: 65058, м. Одеса, пров. Шампанський, 2 (біологічний факультет), ауд. 27.


З дисертацією можна ознайомитись в науковій бібліотеці Одеського національного університету імені І.І. Мечникова за адресою: 65082, м. Одеса, вул. Преображенська, 24.
Автореферат розісланий «____» вересня.


Вчений секретар

спеціалізованої вченої радиД 41.051.06

доктор біологічних наук, професор





Т.О.Філіпова


ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ


Актуальність теми.

Дослідження молекулярно-біохімічних механізмів розвитку печінкової енцефалопатії (ПЕ) – комплексу неврологічних та психічних розладів, що спостерігається у хворих з хронічними захворюваннями печінки чи при портокавальному анастомозі, на сьогодні є досить актуальним. Розвиток печінкової енцефалопатії є багатогранним процесом, у якому приймають участь ряд патогенних факторів. Насамперед, це аміак, рівень якого підвищений за умов хвороб печінки [Shawcross, 2005], також марганець [Rovira, 2008], гама-аміномасляна кислота [Xiao-Qing, 2005], коротколанцюгові жирні кислоти [Минушкин, 2002], меркаптани [Malaguarnera, 2007], поява помилкових медіаторів [Faint, 2006]. За цих умов спостерігається набряк мозку, що розвивається на тлі існування осмотичного та оксидативного стресу, запалення та гіпонатріємії [Jalan, 2005]. Дія токсикантів направлена насамперед на астроцитарні клітини, призводячи до морфологічних та біохімічних змін.

Стан астрогліальних клітин зазвичай оцінюють за рівнем специфічних гліальних протеїнів – Са2+-зв’язуючого білка S-100b та гліального фібрилярного кислого білка (ГФКБ). Гліє-нейрональну взаємодію оцінюють за концентрацією нейрональних молекул клітинної адгезії (НМКА) та станом міжклітинного матриксу, його глікозаміноглікан- та лектин-зв’язуючих компонентів. Вивчення цих білків на сьогодні є досить актуальним, тому що:

Білок S-100b приймає участь у регуляції гомеостазу як астроцитів, так і нервових клітин [Sorci, 2010]. У лабораторії Р. Донато проведені роботи, які крім того показали, що S-100b приймає участь у регуляції фосфорилювання, енергетичного метаболізму, цитоскелетної динаміки, кальцієвого гомеостазу та проліферації й диференціації клітин [Donato, 2009]. Також S-100b у міжклітинному середовищі може бути як нейротрофічним чинником, так і нейротоксичним чинником (в залежності від концентрації) [Van Eldik, 2003]. При ураженні головного мозку різного ґенезу спостерігається зростання рівня S-100b [Kochanek, 2008].

Вагомий внесок у структурну організацію астрогліальних клітин вносить ГФКБ [Pekny, 2004], беручи участь у формуванні цитоскелету клітин та впливаючи на регуляцію їхнього об’єму. Існують дані про зв’язок S-100b та ГФКБ: зростання рівня S-100b призводить до розпаду проміжних філаментів, зменшуючи кількість гліального фібрилярного кислого білка [Pelinka, 2004].

Адгезивні білки відіграють важливу роль у таких процесах як міграція [Schmid, 2008], диференціація нервових клітин [Angata, 2010], відростання нейритів та синаптогенез [Dodla, 2010]. Завдяки своїм адгезивним властивостям НМКА здатні впливати на розмір синаптичної щілини [Dityatev, 2004], що визначає ефективність передачі нервового імпульсу. Також НМКА приймають участь у процесах пізнання [Conboy, 2010] та забезпечення емоційного та психічного стану організму [Brennaman, 2010].

Безперечно важливе значення для функціонування системи «нейрон-астроцит» має міжклітинний матрикс і зокрема його глікозаміноглікан-зв’язуючі компоненти. Вони не тільки можуть регулювати міжклітинні взаємодії [Kastenhuber, 2010], але й впливають на структурну організацію самої клітини. Протеоглікани міжклітинного матриксу здатні впливати на організацію цитоскелету клітини та її поведінку [Dreyfuss, 2009].

Незважаючи на те, що згадані вище протеїни в значній мірі вивчені, залишається нез’ясованим характер кількісного розподілу цих протеїнів у різних відділах мозку та їх роль у процесах, що супроводжують захворювання печінки. Також актуальним є визначення характеру взаємодій між нейронами, глією та міжклітинним матриксом за умов розвитку печінкової енцефалопатії та її корекції препаратами різного типу дії.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася в рамках виконання держбюджетної теми «Молекулярно-клітинні механізми розвитку патологій нервової системи та розробка комплексних методів ранньої діагностики» (№ державної реєстрації 0107U000529) та договору про спільну діяльність із Міжнародним центром молекулярної фізіології НАН України (№1167, 2006-2011 рр.) за темою “Дослідження механізмів формування неоднорідних розподілів мембранних макромолекул та їх ролі у морфо- та електрогенезі нейронів”, а також за договором про співпрацю між Дніпропетровським національним університетом та Люндським університетом (Швеція) (16.05.2005 – 16.05.2008) та науковою темою кафедри біофізики та біохімії Дніпропетровського національного університету ім. О. Гончара «Дослідження молекулярних і клітинних порушень з метою діагностики і корекції» (№ БЕФ-77-07).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було комплексне дослідження співвідношення рівня нейрон- та астроцит-специфічних протеїнів та загальної глікозаміноглікан-зв’язуючої здатності протеїнів міжклітинного матриксу у мозку щурів за умов розвитку печінкової енцефалопатії та її корекції. Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:


  1. провести комплексне дослідження розподілу нейрон- та астроцит-специфічних протеїнів, а також компонентів міжклітинного матриксу у різних відділах мозку експериментальних тварин в нормі;

  2. провести комплексне дослідження розподілу нейрон- та астроцит-специфічних протеїнів, а також компонентів міжклітинного матриксу у різних відділах мозку експериментальних тварин за умов розвитку печінкової енцефалопатії та її корекції;

  3. визначити залежність між рівнем нейрон- та астроцит-специфічних протеїнів у досліджуваних відділах мозку та сироватці крові;

  4. встановити наявність кореляційного зв’язку між рівнем нейрон- та астроцит-специфічних протеїнів та поведінковими реакціями тварин за умов печінкової енцефалопатії та на тлі використання лікарських препаратів.

Об’єкт дослідження – реакція нейронів та астроцитів за умов розвитку експериментальної печінкової енцефалопатії.

Предмет дослідження – співвідношення рівня нейрональних та гліальних протеїнів, а також біохімічних компонентів міжклітинного матриксу за умов розвитку печінкової енцефалопатії та на тлі використання лікарських засобів.

Методи дослідження – біохімічні, імуногістохімічні, лектин-, імуно- та вуглеводферментний аналіз, електрофорез, імуноблотинг, тестування поведінкових реакцій, статистичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше отримані дані щодо розподілу нейрональних молекул клітинної адгезії, білка S-100b, гліального фібрилярного кислого білка, загальної гіалуронат- та WGA-зв’язуючої активності протеїнів з різних відділів мозку щурів за умов експериментального неалкогольного стеатогепатиту (НАСГ) та експериментального хронічного гепатиту (ХГ). Встановлено, що розвиток метіонін-холін дефіцитного неалкогольного стеатогепатиту на 35% знижує рівень S-100b та на 40% кількість мембранної форми НМКА у мозочку та значно (від 26 до 62%) зменшує гіалуронат- та WGA-зв’язуючу активність протеїнів мозочку та задньої частини півкуль. За умов експериментального хронічного гепатиту (ХГ) виявлено значне підвищення рівня досліджуваних протеїнів, так, рівень S-100b збільшувався у десятки разів у мозочку та таламусі, кількість розчинної та мембранної форми НМКА зростала у середньому у 3 рази, як і рівень розчинної форми ГФКБ. Також спостерігали зростання (на 63 – 66%) WGA-зв’язуючої активності протеїнів мозочку та гіпокампу.

Уперше показано вплив лікарських препаратів глутаргіну, цитофлавіну та альфа-кетоглутарату (АКГ) на розподіл нейроспецифічних протеїнів у мозку та сироватці крові щурів за умов патології печінки. Застосування препарату глутаргіну нормалізувало рівень S-100b та цитозольної форми ГФКБ. Застосування цитофлавіну зменшувало кількість цитозольної форми НМКА та ГФКБ, а також кількість S-100b. При використанні альфа-кетоглутарату зменшувався рівень астроцит- та нейрон-специфічних протеїнів, які були підвищені за умов патології. Уперше показана можливість використання альфа-кетоглутарату у якості корегуючого препарату при печінковій енцефалопатії.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані істотно доповнюють сучасні уявлення щодо біохімічних механізмів розвитку печінкової енцефалопатії. Встановлені закономірності співвідношення адгезивних, астрогліальних протеїнів та глікозаміноглікан-зв’язуючої здатності досліджуваних компонентів мозку протягом моделювання неалкогольного стеатогепатиту та хронічного гепатиту мають загальнотеоретичне та практичне значення для оцінки ролі даних протеїнів нервової тканини під час патогенезу печінкових хвороб. Ці нові експериментальні дані впроваджені у навчальний процес на кафедрі біофізики та біохімії Дніпропетровського національного університету та кафедрі інфекційних хвороб Дніпропетровської державної медичної академії. Дані про вплив препаратів глутаргін, цитофлавін та альфа-кетоглутарату на рівень досліджуваних протеїнів у мозку щурів за умов хронічного гепатиту мають практичне значення для застосування їх у лікарській практиці. Існування залежності між рівнем кальцій-зв’язуючого білка S100b у сироватці крові та ступенем важкості розвитку печінкової енцефалопатії за умов хронічного гепатиту можна використовувати для експрес-аналізу.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом було самостійно проаналізовано літературні джерела, проведені експериментальні дослідження та виконана статистична обробка отриманих результатів. Розробка методології та обговорення результатів проведено разом з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації.

Матеріали дисертації були представлені особисто на щорічних наукових підсумкових конференціях Дніпропетровського національного університету ім. О. Гончара (Дніпропетровськ, 2008–2010), X міжнародній молодіжній науково-практичної конференції «Людина і космос» (Дніпропетровськ, 2008), Всеукраїнській науковій конференції з міжнародною участю «Актуальні проблеми сучасної біохімії та клітинної біології» (Дніпропетровськ, 2008), ІV конференції Українського товариства нейронаук з міжнародною участю (Донецьк, 2008), шостій міжнародній науковій конференції «Фальцфейнівські читання – 2009» (Херсон, 2009), Всеукраїнській науково-практичній конференції „Досягнення і перспективи експериментальної і клінічної біохімії” (Тернопіль, 2009), ІХ Міжнародному симпозіумі «Біологічні механізми старіння» (Харків, 2010), COST B30 – Training School “Cellular Neuropathology: In Vitro Models” (Київ, 2010), ECF/EMBO Lecture course «The Cytoskeleton in Development and Pathology», (Швеція, 2010), Х Українському біохімічному з’їзді (Одеса, 2010).

Публікації. За результатами досліджень опубліковано 10 статей та 13 тез у фахових вітчизняних та міжнародних журналах та матеріалах наукових з’їздів й конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 137 сторінках друкованого тексту і складається із вступу, основної частини, що містить огляд літератури, розділ матеріалів та методів досліджень, розділ результатів досліджень, обговорення отриманих результатів та висновки. Робота ілюстрована 1 таблицею та 42 рисунками. Перелік використаних літературних джерел включає 188 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ


В огляді літератури наведені дані про гліє-нейрональні специфічні білки, їх локалізацію, структуру, властивості та функції. Розглянуті сучасні дані про нейромедіатори та специфічні білки головного мозку та біохімічні зміни в головному мозку за ПЕ. Також наведені сучасні біохімічні підходи до розробки засобів корекції ПЕ.

Матеріали та методи досліджень.

Експериментальну частину роботи було проведено на щурах лінії Вістар (56 тварин вагою 160–180 г) та лінії Sprague-Dawley (16 тварин вагою 250–300 г). Тварини знаходилися в стандартних умовах із циклічністю доби: світло – 12 годин, ніч – 12 годин.

Для досліджень використовували мозок та сироватку крові щурів. Декапітацію тварин проводили під ефірним наркозом. Експерименти проводили у відповідності до міжнародних принципів Європейської конвенції «Про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментів та інших наукових цілей» [Страсбург, 1991] та норм біомедичної етики, відповідно до Закону України «Про захист тварин від жорстокого поводження» [Київ, 2006].

Дослідження були проведені з використанням хімічно чистих реагентів фірм Sigma (США), Serva (США), Fluka (Швейцарія), Medix Biochemica (Фінляндія), Boehringer (Німеччина), Реагент (Дніпропетровськ, Україна), MP Bio (Німеччина).

Експериментальна модель метіонін-холін дефіцитного неалкогольного стеатогепатиту була створена на основі моделі [Oz, 2008]. Експериментальна модель хронічного гепатиту була створена за патентом Ніколенко В. Ю., Ніколенко Ю. І. та Ніколенко О. Ю [Ніколенко, 2007]. Після розвитку моделі ХГ вивчався вплив лікарських препаратів глутаргіну («Здоров’я», Україна, 50 мг/кг перорально, протягом 10 днів), цитофлавіну («Полісан», Росія, 0,5 мл/100 г маси тіла тварини інтраперитонеально, протягом 10 днів) та альфа-кетоглутарату (доклінічне дослідження, «Essentis», Швеція, 2,28 г/л питної води, протягом 10 днів).

Фізіологічну активність щурів досліджували за допомогою тестування у відкритому полі за Бурешом [Буреш, 1991]. Гістологічні та імуногістохімічні дослідження проводили за стандартними протоколами [Bullock and Petrusz, 1985]. WGA-ферментний аналіз здійснювали з використанням коньюгату лектин (WGA)-пероксидази хрону.

Для дослідження нейроспецифічних протеїнів, що різняться за місцем локалізації, були отримані різні фракції, що містили водорозчинні, мембраноасоційовані, мембранні та екстрацелюлярні/цитоскелетні білки за допомогою диференціального центрифугування та застосування солюбілізації протеїнів за участю NaCl, тритона Х-100 та сечовини, відповідно [Ушакова, 2005]. Вихідний буфер містив трис – 0,25 мМ (рН7,4), ЕДТО – 1 мМ, дитіотрейтол – 2 мМ, ФМСФ – 0,2 мМ, NaN3 – 3 мМ.



Кількість загального білка (ЗБ) визначали за методом Бредфорд [Bradford, 1985]. Визначення специфічних протеїнів у фракціях тканин мозку та сироватці крові проводили згідно стандартної методики конкурентного імуноферментного аналізу [Нго, Ленхофф, 1988], з використанням моноспецифічних поліклональних антитіл проти нейрональних молекул клітинної адгезії, гліального фібрилярного кислого білку та S-100b, відповідних стандартних протеїнів та антитіл проти IgG кролів, мічених пероксидазою хрону. Для побудови калібрувальних кривих використовували очищені антигени НМКА – Protein Lab (Копенгаген, Данія), S-100b – Sigma (США), ГФКБ – Boehringer (Німеччина). Для оцінки результатів проводили вимірювання оптичної густини на спектрофотометрі “Anthos 2010” при довжині хвилі 492 нм. Кількість протеїнів у пробі визначали як мкг специфічного білка у мілілітрі дослідної фракції (абсолютне значення) та як відношення кількості нейроспецифічного білка до кількості загального білка у даній пробі (мкг НМКА (ГФКБ або S-100b)/ мг ЗБ).

Фракціонування протеїнів по молекулярній масі проводили за методом електрофорезу в ПААГ у присутності додецилсульфату натрію за Леммлі [Laemmli, 1970]. Серед протеїнів, що були розділені під час електрофорезу, астроцитспецифічні протеїни визначали методом вестерн-блотінгу [Stott, 1989] з використанням моноспецифічої антисироватки до ГФКБ. Одночасно гель після електрофорезу фіксували у розчині ТХО – 10% та фарбували іонами срібла [Merril, 1986].

Загальну кількість гіалуронової кислоти у досліджуваних фракціях мозку оцінювали за методом Голда [Gold, 1981]. Для визначення загальної WGA- та гіалуронат-зв'язуючої активності протеїнів в отриманих фракціях мозку був використаний твердофазний вуглевод-ферментний аналіз [Dolzhenko, 1994]. Глікозаміноглікан-зв’язуюча активність протеїнів у пробі оцінювалася, як відношення кількості WGA або гіалуронової кислоти, що зв’язалась із сорбованими білками проби до кількості загального білка у даній пробі (нг/мг ЗБ). Визначення активності аспартатамінотрансферази та аланінамінотрансферази в сироватці крові щурів проводилося динітрофенілгідратним методом Райтмана-Френкеля. Рівень сечовини в сироватці крові щурів оцінювали діацетилмонооксимним методом.

Статистичну обробку результатів проводили за допомогою програм Statwin та Excel, використовуючи t-критерій Ст’юденту та U-критерій Уілкоксона (Манна-Уітні). Вірогідним вважали результати, якщо р0,05. Кореляційний аналіз проводили за допомогою програми Excel, використовуючи пакет «Кореляційний аналіз».


РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ


Зміни у мозку щурів за умов розвитку неалкогольного стеатогепатиту.

Розвиток експериментального метіонін-холін дефіцитного неалкогольного стеатогепатиту призводив до значного (у 4,8 рази) зменшення ваги тіла щурів протягом 16 тижнів – з 478,2±12,2 г у контрольній групі до 99,1±3,9 г у щурів з НАСГ, із стартовою масою 250±30 г. Вага мозку тварин також зменшилась (з 2,1±0,03 г до 1,7±0,01 г). При цьому масова доля мозкової тканини у загальній масі тварин збільшилась – в контрольній групі маса мозку складала 0,5% від маси тварини, а за умов розвитку неалкогольного стеатогепатиту – 1,7%.

За НАСГ спостерігали зменшення кількості нейроспецифічних протеїнів (рис. 1). Кількість НМКА у мембранній фракції протеїнів мозку щурів зменшилась на 40% у мозочку. Концентрація S100b зменшилась у мозочку на 35% та y задній частині півкуль на 18% . Рівень розчинного ГФКБ у мозочку щурів не відрізнявся від контрольних тварин і складав 16,6±1,7 мкг/мл (у контрольних тварин 16,7±2,4 мкг/мл). У задній частині півкуль абсолютний рівень розчинного ГФКБ зменшився на 21%. Найбільш суттєві зміни були зареєстровані у кількості філаментного ГФКБ при розвитку неалкогольного стеатогепатиту, яка була зменшена у мозочку на 75% та майже не змінювалась у задній частині півкуль.

Значне зменшення як S100b, так і філаментного ГФКБ у мозочку вказує на те, що саме у цьому відділі мозку щурів під впливом довготривалої метіонін-холін-дефіцитної дієти відбулися дегенеративні зміни астрогліальних клітин.




Рис 1. Рівень нейроспецифічних протеїнів у мозку щурів: за контрольних умов та розвитку неалкогольного стеатогепатиту . М – мозочок, ЗЧП – задня частина півкуль, n = 8, * – р < 0,05, ** – p < 0,01, *** – p < 0,001.


Імуногістохімічне дослідження підтвердило суттєву деградацію астроцитів під час розвитку експериментального неалкогольного стеатогепатиту у щурів – зменшення розмірів астроцитів, їх зірчастості, суттєве зменшення центрів зв’язування лектину.

Розвиток печінкової енцефалопатії за умов експериментального хронічного гепатиту.

Розвиток експериментального ХГ призводив в основному до збільшення кількості нейроспецифічних протеїнів (рис. 2). Концентрація НМКА в мембранній фракції мозку щурів за умов розвитку хронічного гепатиту значним чином збільшилась.
ЗГШ

МШ
Так, у мозочку концентрація збільшилась у 2,5 рази, у соматосенсорній частині кори півкуль – у 5,1 рази, у таламусі – у 3 рази, у гіпокампі – 2,3 рази. Рівень S-100b зростав у всіх відділах мозку щурів. Найбільше зростання спостерігалось у мозочку – у 12,1 рази, трохи менше – у 10,6 рази кількість S-100b зросла у таламусі, у соматосенсорній частині кори півкуль та гіпокампі рівень S-100b зріс у 4,5 та 4,7 рази відповідно. Концентрація розчинного ГФКБ значно збільшувалась. Найбільші зміни спостерігались у соматосенсорній частині кори півкуль та у таламусі (зростання у 5,6 рази).

На тлі значного збільшення концентрації цитозольного ГФКБ концентрація філаментного ГФКБ змінювалась різнопланово. Так, у гіпокампі його рівень зростав (на 89%), у мозочку та таламусі – зменшувався (на 36% та 24% відповідно), а у соматосенсорній частині кори півкуль концентрація майже не змінювалась.



Рис. 2. Рівень нейроспецифічних протеїнів у мозку щурів: за контрольних умов та за умов розвитку експериментального хронічного гепатиту . М – мозочок, СЧ – сенсорна частина кори півкуль, Т – таламус, Г – гіпокамп, n = 8, * – р < 0,05, *** – p < 0,001.
Збільшення кількості НМКА вказує на встановлення більш щільних контактів між нейронами за умов моделювання хронічного гепатиту. Отримані величини концентрації S100b складаються як з концентрації цитозольної його форми, так і з концентрації експресованих астроглією позаклітинних молекул S100b. Тому збільшення концентрації S100b за умов розвитку хронічного гепатиту може свідчити про декілька процесів, що можливо відбуваються одночасно: активацію астроцитів під час ураження мозку, про астрогліоз, про збільшення експресії S100b у міжклітинний простір та про підсилення його транспорту у позаклітинний матрикс. З врахуванням сучасних наукових робіт [Leite M. C., 2006] та наших даних ми вважаємо, що збільшення цитозольного ГФКБ у мозку щурів при відносно незмінній кількості його філаментної форми може свідчити про унеможливлювання агрегації структурних одиниць ГФКБ у проміжні філаменти на тлі збільшення експрессії S100b.

Розвиток ПЕ під час розвитку хронічного гепатиту призводив до змін у гіалуронат-зв’язуючій активності протеїнів мозку. У цитозольній фракції мозочка кількість зв’язаного гіалуронату зменшилась на 66% − з 4,06±0,59 нг зв’яз. ГК /мг ЗБ до 1,79±0,23 нг зв’яз. ГК /мг ЗБ, у гіпокампі зменшення досягло 63% − з 2,83±0,28 нг зв’яз. ГК /мг ЗБ до 1,05±0,15 нг зв’яз. ГК /мг ЗБ. Значне зменшення гіалуронат-зв’язуючої активності протеїнів мозку вказує на конформаційні зміни у структурі молекул протеїнів, що зв’язуються з гіалуроновою кислотою.

Проведені нами імуногістохімічні дослідження свідчать, що за умов розвитку експериментального хронічного гепатиту частина астроцитів втратила свою характерну зірчасту форму та набрякла.

Особливості процесів взаємодій в комплексі нейрон-астроцит за умов печінкової енцефалопатії під час неалкогольного стеатогепатиту та хронічного гепатиту.

Неалкогольний стеатогепатит – самостійна нозологічна одиниця, для якої характерні підвищення активності ферментів печінки в крові й морфологічні зміни в біоптатах печінки, подібні до змін при алкогольному гепатиті, але які спостерігаються у осіб, що не вживають алкоголь. Біохімічні механізми, що пов’язані з НАСГ, усе ще не з’ясовані, але існують свідчення, що інсулінорезистентність є головним фактором , що спричинює це захворювання [El-Zayadi, 2008]. До того ж циркулюючі запальні цитоксини (тобто TNF-α, IL-6), а також знижені протизапальні фактори (тобто адипонектин, IL-10) [Tsochatzis, 2009] також мають відношення до неалкогольного стеатогепатиту. Ці запальні механізми є основою розвитку НАСГ і важких станів. Треба брати до уваги також той факт, що у нашій роботі моделювання неалкогольного стеатогепатиту відбувалося за допомогою метіонін-холін дефіцитної дієти. Тобто було зменшене надходження амінокислот, що спричиняло недостатній синтез протеїнів.

Таким чином, за отриманими нами даними при експериментальному метіонін-холін-дефіцитному неалкогольному стеатогепатиті кількість цитозольної форми нейрональних молекул клітинної адгезії не змінювалось на тлі зменшення їх мембранної форми. Зменшувалась кількість кальцій-зв’язуючого білка S100b та філаментої форми гліального фібрилярного кислого білка. Також зменшувалась WGA- та гіалуронат-зв’язуюча активність протеїнів. Імуногістохімічний аналіз вказує на зменшення об’єму соми та кількості відростків астроцитів у внутрішньогранулярному шарі мозочка, що свідчить про погіршення трофічної функції цих клітин. На основі аналізу отриманих нами результатів ми припускаємо, що розвиток печінкової енцефалопатії на тлі експериментального НАСГ спричинений зниженням синтезу досліджуваних протеїнів, що в свою чергу призводить до зменшення об’єму астроцитів та кількості їх відростків, зменшення сили адгезивних зв’язків між нейронами та астроцитами (рис. 3) й відповідно, – погіршення забезпечення нейронів енергією та синаптичної передачі нервового сигналу.

Етіологія розвитку печінкової енцефалопатії при захворюванні на хронічний гепатит має іншу біохімічну картину. Спочатку починає розвиватись фіброз печінки, що призводить до збільшення кількості клітин сполучної тканини та заміщенням ними гепатоцитів [Павлов, 2007]. Таким чином погіршується здатність печінки до детоксикаційної функції. У крові спостерігається збільшення токсичних продуктів (а саме аміаку), що можуть проникати крізь гематоенцефалічний бар’єр. Аміак, потрапивши у головний мозок, елімінується астроцитами. За умов збільшення його кількості, астроцити не справляються з цим навантаженням та у них починає розвиватися набряк [Butterworth, 2010]. Саме збільшення кількості аміаку при розвитку хронічного гепатиту є основним фактором появи печінкової енцефалопатії.


мНМКА ↓,

S100b ↓,

фГФКБ ↓

НМКА ↑,

S100b ↑,

цГФКБ ↑

Рис. 3. Гіпотетична схема змін, що відбуваються у нейрон-гліальному комплексі за умов розвитку печінкової енцефалопатії при експериментальному метіонін-холіндефіцитному неалкогольному стеатогепатиті та експериментальному хронічному гепатиті: Н – нейрон, А – астроцит, С – синапс, стрілками вказані області змін.


Результати наших досліджень вказують на те, що при експериментальному ХГ збільшувались як рівень цитозольної форми, так і кількість мембранної форми НМКА. Збільшувались рівні S100b та цитозольної форми ГФКБ. Також збільшувалась WGA-зв’язуюча активність протеїнів, при зниженні гіалуронат-зв’язуючої активності. Під час розвитку ПЕ на тлі ХГ спостерігався набряк астроцитів, при цьому збільшувався рівень мембранної форми НМКА (рис. 3). Ця зміна кількості НМКА можливо забезпечує компенсаторний механізм передачі синаптичного сигналу при погіршенні виконання астроцитами своїх функцій.

Вплив глутаргіну, цитофлавіну та альфа-кетоглутарату на розподіл нейрон- та астроцитспецифічних протеїнів за умов розвитку експериментального хронічного гепатиту

Основні результати застосування лікарських препаратів глутаргіну, цитофлавіну та альфа-кетоглутарату представлені на рис. 4.




Рис. 4. Рівень астроцит-специфічних протеїнів за умов розвитку експериментального хронічного гепатиту та його корекції, n = 8, * – p < 0,05, ** − p < 0,01, *** – p < 0,001 (порівняння з контрольною групою), # – р < 0,05 ## – р < 0,01, ### – р < 0,001 (у порівнянні з групою з хронічним гепатитом). М – мозочок, СЧ – соматосенсорна частина кори півкуль, Т – таламус/ гіпоталамус, Г – гіпокамп.


Під впливом глутаргіну відбувався перехід цитозольної форми ГФКБ у його філаментну форму, тобто формування цитоскелету астроциту. При цьому спостерігалося збільшення рівня S100b тільки у гіпокампі, що може пояснюватись особливістю секреції кальцій-залежних протеїнів у міжклітинний простір у цій структурі мозку під час ураження головного мозку.

У гіпокампі та мозочку при вживанні альфа-кетоглутарату відбувалися зміни у силі адгезивної взаємодії між нейронами – концентрація НМКА у мозочку зменшилась, у гіпокампі збільшилась. Зменшення концентрації S-100b є беззаперечно свідченням покращення стану головного мозку щурів під впливом альфа-кетоглутарату. У той же час зменшення кількості цитозольного ГФКБ при збільшенні його філаментної форми під впливом альфа-кетоглутарату може свідчити про стимулювання ним астрогліозу як компенсаторного механізму при ураженні головного мозку.

Цитофлавін сприяв збільшенню адгезивних зв’язків між нейронами за рахунок збільшення кількості мембранно-асоційованих молекул НМКА. Рівень S-100b, що є адекватним показником ступені ураження ЦНС, під впливом цитофлавіну знизився.

На рис. 5 представлені результати вестерн-блотингу філаментної фракції мозку щурів (фарбування антитілами до ГФКБ).

Рис. 5. Вестерн-блотинг філаментної фракції мозку щурів (фарбування антитілами до ГФКБ). К – контрольна група щурів, ХГ – група щурів з розвитком хронічного гепатиту, ХГ+АКГ – група щурів після вживання альфа-кетоглутарату 0,228% у питній воді, протягом 10 днів.
Розвиток печінкової енцефалопатії призводить до перерозподілу між молекулами у сторону розпаду гліального фібрилярного кислого білка на менші субодиниці. Особливо сильно цей процес відбувається у мозочку. Введення альфа-кетоглутарату затримує та повертає цей процес у протилежний бік.

Кореляція розподілу нейрон- та астроцитспецифічних протеїнів та поведінки щурів за умов моделювання ХГ.

Протікання ПЕ незначним чином зменшувало локомоторну активність тварин різних досліджуваних груп (рис. 6). Це супроводжувалося значним збільшенням усіх нейроспецифічних протеїнів у мозочку щурів. Виявлено, що існує пряма залежність між локомоторною активністю тварин та рівнем філаментного ГФКБ (r = 0,94) та зворотна залежність між рівнем цитозольної форми ГФКБ та локомоторною активністю тварин (r = -0,68).

Можливо, у випадку розвитку ПЕ збільшення кількості вказаних протеїнів пов’язане не тільки зі збільшеним їх продукуванням, але й з астрогліозом, що сприяв зменшенню локомоторної активності хворих тварин. Застосування альфа-кетоглутарату, так і цитофлавіну позитивно впливало на локомоторну активність щурів. При цьому показники досліджуваних нейроспецифічних протеїнів також нормалізувалися.

Протікання ПЕ значним чином впливає на пізнавальну активність щурів (рис. 6). Кількість підіймань та кількість заглядань у нірки значно зменшились. Ці зміни пізнавальної активності відбувалися при суттєвому збільшенні вмісту всіх нейроспецифічних молекул у гіпокампі, особливо це було характерно для S100b (у 4,7 рази). Застосування цитофлавіну та альфа-кетоглутарату давало змогу тваринам проявити пізнавальну активність, навіть більшу ніж у щурів контрольної групи.

Рис. 6. Локомоторна та пізнавальна активність щурів: за контрольних умов , розвитку хронічного гепатиту , після лікування щурів альфа-кетоглутаратом та після лікування щурів цитофлавіном , n = 8, * – p < 0,05, ** − p < 0,01 (порівняння з контрольною групою), ## – р < 0,01, ### – р < 0,001 (у порівнянні з групою з хронічним гепатитом).


Кореляційний аналіз свідчить про зворотний зв’язок між рівнем S100b та пізнавальною активністю щурів (r = -0,85). Також зворотна залежність встановлена між кількістю цитозольного ГФКБ та рівнем пізнавальної активності (r = -0,76). Тобто патологічне збільшення рівня цих протеїнів призводило до зменшення пізнавальної активності і навпаки. Пряма залежність існувала між рівнем мембранного НМКА та рівнем пізнавальної активності (r = 0,54).

Зміни рівня S100b у сироватці крові щурів за умов розвитку хронічного гепатиту та застосування альфа-кетоглутарату та цитофлавіну.

За умов розвитку експериментального хронічного гепатиту спостерігали значне збільшення рівня S100b у всіх відділах мозку щурів, що свідчить про ураження гліальних клітин. Як відомо, дія S100b залежить від його рівня − на наномолярному рівні він виступає як стимулюючий фактор, у той час як у мікромолярній концентрації він призводить до токсичної дії [Rothermundt M., 2003]. Розвиток ПЕ призводить до збільшення проникності гематоенцефалічного бар’єру [Полунина Т. Е., 2010], функціонування якого забезпечується саме гліальними клітинами.

Розвиток ХГ супроводжувався значним (у 4,68 рази) збільшенням рівня S100b у сироватці крові щурів (рис. 7). Вживання альфа-кетоглутарата призводило до зниження концентрації S100b майже до контрольного рівня, але цитофлавін не змінював рівень S100b. Таким чином, S100b, рівень якого значно підвищився за умов моделювання ХГ, проникає крізь гематоенцефалічний бар’єр та тому визначення його рівня в сироватці крові може бути використане як маркер печінкової енцефалопатії.




Рис. 7. Рівень кальцій-зв’язуючого протеїна S100b у сироватці крові щурів, ХГ – тварини з моделюванням хронічного гепатиту, ХГ+АКГ – тварини після лікування альфа-кетоглутаратом, ХГ+Цитофл – тварини після лікування цитофлавіном, n = 8, ** – р < 0,01, *** – р < 0,001 (порівняння з контрольною групою), ### – p<0,001 (у порівнянні з групою з хронічним гепатитом).

Існує пряма кореляційна залежність між рівнями S100b у мозочку та сироватці крові (r = 0,86), у сенсорній частині кори півкуль, таламусі та гіпокампі він трохи нижчий (r = 0,70, r = 0,54 та r = 0,45 відповідно).


ВИСНОВКИ


У дисертаційній роботі вперше проведено дослідження процесів перебігу печінкової енцефалопатії за умов експериментального неалкогольного стеатогепатиту та хронічного гепатиту з точки зору взаємодій в комплексі нейрон-астроцит, досліджено співвідношення рівня нейроспецифічних протеїнів у різних відділах мозку щурів та їх поведінкових реакцій за умов розвитку печінкової енцефалопатії різного ґенезу та застосуванні корегуючих препаратів глутаргіну, цитофлавіну та альфа-кетоглутарату.

  1. Встановлено, що для метіонін-холін дефіцитного неалкогольного стеатогепатиту характерно гальмування продукції нейроспецифічних протеїнів, деградація гліальних клітин та зменшення кількості адгезивних молекул (найбільш ураженим відділом мозку щурів є мозочок – зниження рівня мембранної НМКА на 40%, кальцій-зв’язуючого білка S-100b на 35%, філаментного ГФКБ на 75%).

  2. Встановлено, що за експериментального хронічного гепатиту збільшується кількість адгезивних молекул на фоні збільшеного продукування нейроспецифічних протеїнів (найбільші зміни характерні для мозочку та гіпокампу – збільшення рівня мембранної форми НМКА на 195% та 147%, кальцій-зв’язуючого білка S-100b на 1100% та 366%, мембранного ГФКБ на 321% та 257% відповідно), що супроводжується набряком астроцитів.

  3. Виявлена пряма кореляційна залежність між рівнем кальцій-зв’язуючого протеїна S100b у сироватці крові та його рівнем у головному мозку (від r = 0,45 у гіпокампі до r = 0,86 у мозочку) під час розвитку печінкової енцефалопатії за умов хронічного гепатиту, що можна використовувати для експрес-аналізу.

  4. За умов розвитку експериментального хронічного гепатиту встановлена залежність між характером розподілу нейроспецифічних протеїнів у мозку щурів та їх фізіологічними реакціями: пряма залежність між локомоторною активністю тварин та рівнем філаментної форми ГФКБ (r = 0,86) та зворотна залежність між рівнем цитозольної форми ГФКБ та локомоторною активністю тварин (r = -0,43), зворотній зв’язок між пізнавальною активністю щурів та рівнем кальцій-зв’язуючого білка S100b (r = -0,72) і цитозольною формою гліального фібрилярного кислого білка (r = -0,64) та прямий зв’язок між рівнем мембранної форми нейрональних молекул клітинної адгезії та рівнем пізнавальної активності (r = 0,74).

  5. Застосування препаратів глутаргіну, цитофлавіну та альфа-кетоглутарату запобігає розвитку суттєвих змін рівня нейрон- та астроцитспецифічних протеїнів у мозку щурів за умов печінкової патології. Рівень протеїну S100b вірогідно не змінюється при застосуванні цитофлавіну та альфа-кетоглутарату на фоні розвитку хронічного гепатиту. Найбільш ефективними виявилися альфа-кетоглутарат та цитофлавін.


СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ




  1. Фоменко О. З. Печінкова енцефалопатія. Огляд / О. З. Фоменко, Г. О. Ушакова // Вісник Дніпропетровського Університету. Серія Медицина і охорона здоров’я. – 2008. – Т. 16, № 8. – С. 110–117. (Дисертант зробив огляд літератури за темою).

  2. Ushakova G. A. Non-alcoholic steatohepatitis induce а decreas the S100-b in level in the rat brain / G. A. Ushakova, O. Z. Fomenko and S. G. Pierzynowski // Neurophysiology. – 2008. – Vol. 40, № 4. – P. 373–375. (Дисертант дослідив зміни рівня S100b за умов розвитку метіонін-холін дефіцитного неалкогольного стеатогепатиту).

  3. Шевченко О. П. Зміни активності матриксних металопротеїназ та глікозаміногліканів за умов індукованого хронічного гепатиту у щурів / О. П. Шевченко, О. З. Фоменко, А. І. Шевцова [та ін.] // Одеський медичний журнал. – 2009. – № 6. – С. 31–33. (Дисертант вивчив зміни активності глікозаміногліканів за умов експериментально хронічного гепатиту).

  4. Фоменко О. З. Вплив неалкогольного стеатогепатиту та хронічного гепатиту С на розподіл нервовоспецифічних протеїнів у мозку щурів / О. З. Фоменко, Г. О. Ушакова // Нейронауки: теоретичні та клінічні аспекти. – 2009. – Т. 5, №1–2. – С. 24–28. (Дисертант вивчив розподіл нейрон- та астроцит специфічних протеїнів за умов експериментальних ушкоджень печінки).

  5. Фоменко О. З. Рівень гіалуронату та загальної гіалуронат-зв’язуючої активності протеїнів за умов розвитку експериментального хронічного гепатиту С / О. З. Фоменко, Г. О. Ушакова // Медична хімія. – 2009. – Т. 11, № 3. – С. 54–56. (Дисертант провів дослідження гіалуронат-зв’язуючої властивості мозку щурів).

  6. Фоменко О. З. Лектин - связывающая активность белков мозга при дефиците метионина и холина / О. З. Фоменко, К. А. Абдулахатова, Г. А. Ушакова // «Природничий альманах» серія: Біологічні науки – 2009.– вып. № 12. – С. 228–233. (Дисертант провів дослідження лектин-зв’язуючої активності протеїнів мозку щурів).

  7. Ushakova G. Non-invasive markers of hepatic encephalopathy under chronic hepatitis C and 2-oxoglutarate treatment / Ushakova G., Fomenko O., S. Pierzynowski // „Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska”, SECTIO DDD. – 2010 – Vol. 23, № 3. – P. 203–206. (Дисертант провів дослідження неінвазивних маркерів енцефалопатії під час моделювання ПЕ).

  8. Фоменко О. З. Протеїни астроглії у мозку щурів в умовах експериментального хронічного гепатиту та дії 2-оксоглутарата / О. З. Фоменко, Г. О. Ушакова, С. Г. Пієржиновський // Український біохімічний журнал. – 2011. – Т. 83, № 1. – С. 69–75. (Дисертант провів дослідження змін рівня нейрон- та астроцитспецифічних протеїнів за умов моделювання ХГ).

  9. Фоменко О. З. Изменение поведенческих реакций крыс при развитии экспериментального хронического гепатита / О. З. Фоменко, Г. А. Ушакова, С. Г. Пиержиновський // Материалы Международной научно-практической конференции "Теоретические и прикладные проблемы современной науки и образования", Курск, Россия. − 2011.− Ч. 1. − С. 222–228. (Дисертант провів дослідження поведінкових реакцій щурів та змін рівня нейрон- та астроцитспецифічних протеїнів).

  10. Ushakova G. Downregulation of the level of astroglial proteins in the rat brain by dietary alpha-ketoglutarate under experimental chronic hepatitis / G. Ushakova, O. Fomenko, S. Pierzynowski // International Conference on “Advanced in Microbiology and Biotechnology for Human and Animal Health”. – 2011. – P. 34 –37. (Дисертант провів дослідження змін рівня астроцитспецифічних протеїнів протеїнів за умов моделювання ХГ та вживання АКГ).

  11. Фоменко О. З. Зниження глікозаміноглікан-зв’язуючої протеїнів мозку щурів, що розвивалися за умов дефіциту метіоніну та холіну / О. З. Фоменко, Фурсова Н. О., Г. О. Ушакова // Материалы международного симпозиума „Биологические механизмы старения”, Харьков. – 2008.– С. 25.

  12. Фоменко О. З. Зміни у мозку щурів під час розвитку хронічного гепатиту С / О. З. Фоменко, Г. О. Ушакова // Материалы всеукраинской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной биохимии и клеточной биологии», Дн-ск, ДНУ. – 2008.– С. 59.

  13. Фоменко О. З. Зміни концентрації гліальних протеїнів у процесі розвитку експериментального стеатогепатиту / О. З. Фоменко, Г. О. Ушакова // Збірник тез доповідей X міжнародної молодіжної науково-практичної конференції «Людина і космос», Дн-ськ, НЦАОМУ. – 2008. – С. 283.

  14. Фоменко О. З. Зміни концентрації S100- внаслідок розвитку печінкової енцефалопатії у мозку щурів під час експериментального стеатогепатиту / О. З. Фоменко, Г. О. Ушакова // Тези IV конференції українського товариства нейронаук з міжнародною участю (Донецьк – Слав’янськ 2008 рік). – Нейронауки: теоретичні та клінічні аспекти. – т.4, №1(додаток). – 2008. – С. 157.

  15. Фоменко О. З. Зміни астроцитарної активності в умовах патогенезу печінки / О. З. Фоменко, О. В. Колбінєва, Г. О. Ушакова // Матеріали 9 міжнародної междисциплінарної научково-практичної школи-конференції „Сучасні проблеми науки та освіти”, Харків – Алушта. – 2009. – С. 126 – 127.

  16. Фоменко О. З. Влияние хронического гепатита С на распределение нейроспецифических белков в мозге крыс / О. З. Фоменко, Г. А. Ушакова // Материалы 3 международной научной конференции «Экспериментальная и клиническая фармакология», Минск. – 2009. – С. 116 – 118.

  17. Фоменко О. З. Розвиток печінкової енцефалопатії під час моделювання хронічного гепатиту С / О. З. Фоменко, Г. О. Ушакова // Материалы IX международного симпозиума „Биологические механизмы старения”, Харьков. – 2010. – С. 74 – 75.

  18. Фоменко О. З. Влияние моделирования хронического гепатита С на изменения концентрации S-100B / О.З. Фоменко, Г.А. Ушакова // Матеріали Четвертої Всеукраїнської наукової конференції студентів, аспірантів і молодих учених «Хімічні проблеми сьогодення», Донецьк. – 2010. – С. 272.

  19. Фоменко О. З. Изменения концентрации S-100B при моделировании хронического гепатита С / О. З. Фоменко, Г. А. Ушакова // Материалы VII Международной научной конференции молодых ученых, посвященной 70-летию Адыгейского государственного университета «Наука. Образование. Молодежь», Майкоп, Россия. – 2010. – т. 1. – С. 61–64.

  20. Fomenko O. The changes of GFAP level in the rat brain under chronic hepatitis C condition and effect of the alfa-ketoglutarate / O. Fomenko, G. Ushakova and S. Pierzynowski // The abstract book of a FEBS/EMBO Lecture Course “The cytoskeleton in development and pathology”, Djurönäs, Stockholm Archipelago, Sweden, June 19-24. – 2010. – Р. 156.

  21. Fomenko O. The changes of S100b level in the rat brain under chronic hepatitis C condition and effect of the alfa-ketoglutarate / O. Fomenko, G. Ushakova and S. Pierzynowski // The abstract book of COST B30 Training School “Cellular neuropathology: in vitro model”, June 2010. – 2010. – Р. 35.

  22. Фоменко О. З. Розподіл гліального фібрилярного кислого протеїну за умов хронічного гепатиту С та лікування цитофлавіном / О. З. Фоменко, Г. О. Ушакова // Матеріали X Українського біохімічного з’їзду 13-17 вересня 2010 р., м. Одеса. – 2010. – т. 82, № 4 (додаток 2). – С. 185–186.

  23. Шевченко О. П. Вплив цитофлавіну на процеси регенерації печінки та вміст компонентів екстрацелюлярного матриксу при експериментальному гепатиті у щурів / О. П. Шевченко, О. З. Фоменко // Актуальні питання фармацевтичної і медичної науки та практики-2011: матеріали Всеукр. наук.-практ. конф. з міжнар. участю «Сучасні аспекти медицини і фармації-2011». – Запоріжжя, 2011. - Вип. XXIV № 2, додаток. – С.18.



АНОТАЦІЯ



Фоменко О.З. Вміст, тканинний розподіл та біохімічні властивості нейрон- та астроцит-специфічних протеїнів за експериментальної енцефалопатії. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Одеський національний університет імені І.І. Мечникова, Одеса, 2011.

Досліджено співвідношення між рівнем нейрон- та астроцит-специфічних протеїнів (кальцій-зв’язуючого протеїна S100b, гліального фібрилярного кислого білка, нейрональної молекули клітинної адгезії) та загальною глікозаміноглікан-зв’язуючою здатністю протеїнів міжклітинного матриксу у мозку щурів за умов розвитку печінкової енцефалопатії різної етіології та її корегування.

Метіонін-холін дефіцитний неалкогольний стеатогепатит супроводжувався гальмуванням продукції нейроспецифічних протеїнів, деградацією гліальних клітин та зменшенням кількості адгезивних молекул; найбільш ураженим відділом мозку щурів виявився мозочок. Експериментальний хронічний гепатит супроводжувався набряком астроцитів та збільшенням кількості адгезивних молекул на фоні збільшеного продукування нейроспецифічних протеїнів, найбільші зміни характерні для мозочку та гіпокампу

За умов розвитку експериментального хронічного гепатиту виявлена пряма залежність між локомоторною активністю тварин та філаментним ГФКБ (r = 0,86) та зворотна залежність між цитозольним ГФКБ та локомоторною активністю тварин (r = -0,43). Встановлено зворотній зв’язок між пізнавальною активністю щурів та рівнем S100b (r = -0,72), цитозольним ГФКБ (r = -0,64) та прямий зв’язок між мембранною НМКА та рівнем пізнавальної активності (r = 0,74).

Пряма кореляційна залежність (r = 0,5–0,86) між рівнем кальцій-зв’язуючого білка S100b у сироватці крові та його рівнем у головному мозку під час розвитку печінкової енцефалопатії за умов хронічного гепатиту може бути використана для експрес-аналізу.

Застосування препаратів глутаргін, цитофлавін та альфа-кетоглутарату запобігає розвитку змін рівня нейрон- та астроцитспецифічних протеїнів у мозку щурів під час печінкової патології. Найбільш ефективними виявилися альфа-кетоглутарат та цитофлавін.

Ключові слова:

S100b, гліальний фібрилярний кислий білок, нейрональна молекула клітинної адгезії, гіалуронат-зв’язуючі протеїни, неалкогольний стеатогепатит, хронічний гепатит, печінкова енцефалопатія.

АННОТАЦИЯ



Фоменко О. З. Содержание, распределение в тканях и биохимические свойства нейрон- и астроцит-специфических белков при экспериментальной энцефалопатии. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Одесский национальный университет имени И.И. Мечникова, Одесса, 2011.

Изучены соотношения между уровнями нейрон- и астроцит-специфических белков (кальций-связывающего белка S100b, глиального фибриллярного кислого белка, нейрональной молекулы клеточной адгезии) и общей гликозаминогликан-связующей способности белков межклеточного матрикса в мозге крыс в условиях развития печеночной энцефалопатии различной этиологии и ее коррекции.

Метионин-холин дефицитный неалкогольный стеатогепатит сопровождался уменьшением продукции нейроспецифических белков, деградацией глиальных клеток и уменьшением количества адгезивных молекул; наиболее пораженным отделом мозга крыс выявился мозжечок. Экспериментальный хронический гепатит сопровождался отеком астроцитов и увеличением количества адгезивных молекул на фоне увеличенного продуцирования нейроспецифических белков, наибольшие изменения происходили в мозжечке и гиппокампе. Значительное уменьшение гиалуронат-связывающей активности белков мозга может указывать на конформационные изменения в структуре молекул белков, связывающихся с гиалуроновой кислотой. Иммуногистохимические исследования показали, что в условиях развития экспериментального хронического гепатита часть астроцитов теряет свою характерную звездчатую форму и отекает.

В условиях развития экспериментального хронического гепатита существует прямая зависимость между локомоторной активностью животных и уровнем филаментной формы ГФКБ (r = 0,86) и обратная зависимость среднего значения между уровнем цитозольной формы ГФКБ и локомоторной активностью животных (r = -0,43). Также установлена обратная связь между познавательной активностью крыс и уровнем кальций-связывающего белка S100b (r = -0,72), цитозольной формой глиального фибриллярного кислого белка (r = -0,64) и прямая связь между уровнем мембранной формы нейрональных молекул клеточной адгезии и уровнем познавательной активности (r = 0,74).

Существует прямая корреляционная зависимость (r = 0,5–0,86) между уровнем кальций-связывающего белка S100b в сыворотке крови и его уровнем в головном мозге во время развития печеночной энцефалопатии в условиях хронического гепатита, что можно использовать для экспресс-анализа.

Применение препаратов глутаргина ("Здоровье", Украина, 50 мг/кг перорально, в течение 10 дней), цитофлавина ("Полисан", Россия, 0,5 мл/100 г массы тела животного интраперитонеально, в течение 10 дней) и альфа-кетоглутарата (доклиническое исследование, "Essentis", Швеция, 2,28 г/л питьевой воды, в течение 10 дней) предотвращает развитие изменений уровня нейрон- и астроцитспецифических белков в мозге крыс. Наиболее эффективными оказались альфа-кетоглутарат и цитофлавин.

Ключевые слова: S100b, глиальный фибриллярный кислый белок, нейрональная молекула клеточной адгезии, гиалуронат-связывающие белки, неалкогольный стеатогепатит, хронический гепатит, печеночная энцефалопатия.



SUMMARY



Fomenko O. Z. The content, tissue distribution and biochemical properties of neuron- and astrocyte-specific proteins in experimental encephalopathy. – The manuscript.

Dissertation thesis on obtaining the scientific degree of PhD (Biology) in the specialty 03.00.04 – biochemistry. − Odessa National University named after I. I. Mechnikov, Odessa, 2011.

The changes of neuron and astrocyte proteins (Ca-binding protein S100b, glial fibrillar acid protein, neuronal cell adhesion molecule) level and total GAG-binding extracellular matrix protein ability in the rat brain under hepatic encephalopathy condition and their correction were studied.

Methionine-choline deficient non-alcoholic steatohepatitis is accompanied by diminution of neurospesific proteins, degradation of glial cells and decreasing of the amount of adhesive molecules; the cerebellum is the most staggered brain part. Experimental chronic hepatitis is accompanied by the astrocytes edema and increasing of the amount of adhesive molecules as well as neurospesific proteins, the cerebellum and hippocampus have more strong changes.

At the development of experimental chronic hepatitis there was direct cross-correlation dependence between the locomotor’s animal activity and the filament GFAP level (r = 0,86) and the mean reverse cross-correlation dependence between the cytosolic GFAP level and the locomotor’s animal activity (r = -0,43). The reverse cross-correlation dependence between rat’s cognitive activity and S100b level (r = -0,72), cytosolic GFAP level (r = -0,64) and direct cross-correlation dependence between the membrane NCAM level and level of cognitive activity (r = 0,74) was also set.

There is direct cross-correlation dependence (r = 0,5–0,86) between the blood serum S100b level and S100b level in a cerebellum at the hepatic encephalopathy.



Administration of Glutarginum ("Health", Ukraine, 50 mg/kg orally per day, during 10 days), Cytoflavin ("Polisan", Russia, 0,5 ml/100 g of animal body mass per day peritonealy, during 10 days) and intermediate metabolite alpha-ketoglutarate (before clinic research, "Essentis", Sweden, 2,28 g/l of drinking-water, during 10 days) prevented the development of neurospecific proteins changes in the rat’s brain. Alpha-ketoglutarate and Cytoflavin were more effective.

Key words:

S100b, GFAP, NCAM, GAG-binding proteins, NASH, chronic hepatitis, hepatic encephalopathy.

Карта сайта

Последнее изменение этой страницы: 2018-09-09;



2010-05-02 19:40
referat 2018 год. Все права принадлежат их авторам! Главная